Быстрый метод исследования для обнаружения клещей Tropilaelaps (Mesostigmata: Laelapidae)

Паразитические клещи Tropilaelaps (Delfinado и Baker) являются вредителями европейских медоносных пчел (Apis mellifera L.) в Азии. Эти клещи представляют значительную угрозу в случае занесения в другие регионы мира, что оправдывает проведение эпиднадзора за клещами Tropilaelaps в незараженных регионах. Существующие методы обнаружения клещей Tropilaelaps непригодны для эффективного крупномасштабного скрининга. Мы разработали и протестировали новый метод обнаружения клещей, который заключается в том, что рамка с расплодом медоносных пчел плотно прижимается к поддону. Наш метод был проще в реализации, чем существующие тесты на обнаружение, сократил время, затрачиваемое на каждую пасеку, и минимизировал уничтожение расплода. Это повышение целесообразности компенсирует низкую скорость обнаружения зараженных колоний (чувствительность; 36,3% для теста с ударом, 54,2% и 56,7% для двух наиболее чувствительных методов, используемых в настоящее время в Азии). Учитывая такую чувствительность, мы предлагаем, чтобы программы скрининга отбирали по семь колоний на пасеку (независимо от размера пасеки) и 312 случайно выбранных пасек в регионе, чтобы быть на 95% уверенными в обнаружении зарождающейся инвазии клеща Tropilaelaps. Дальнейшие анализы опровергают существующее мнение, что клещи Tropilaelaps предпочитают расплодные ячейки трутневых пчел. Уровень заражения клещами Tropilaelaps составил 3,5 ± 0,9% в трутневом расплоде и 5,7 ± 0,6% в рабочем расплоде. Мы предлагаем бамп-тест в качестве стандартного инструмента для мониторинга присутствия клещей Tropilaelaps в регионах, которые считаются свободными от инвазии. Однако регулирующие органы могут предпочесть чувствительность теста «Капля» (сбор клещей, падающих на дно улья на липкие доски) менее затратному по времени тесту «Кочка».

---

Европейская медоносная пчела (Apis mellifera L.), наиболее часто используемый управляемый опылитель в Соединенных Штатах, опыляет 100 североамериканских коммерческих культур и непосредственно вносит от 5 до 10 миллиардов долларов в экономику США ежегодно (2005 скорректированный $; NRC 2006). Снижение здоровья медоносных пчел было зафиксировано в течение 50 лет (vanEngelsdorp and Meixner 2010), а потери зимующих медоносных пчел составляли ∼30% ежегодно в США в течение последних пяти зим (vanEngelsdorp et al. 2008, 2010, 2011, 2012). Управляемые колонии подвергаются риску от нескольких вредителей и болезней, включая паразитических клещей. В настоящее время клещ Варроа (Varroa destructor Anderson and Trueman) считается самой большой угрозой для управляемых медоносных пчел в США (Rosenkranz et al. 2010, vanEngelsdorp et al. 2012). Другие паразитические клещи, такие как клещи рода Tropilaelaps (Delfinado и Baker), вызывают значительные потери в таких странах, как Таиланд, Филиппины и Пакистан (Camphor и др. 2005). Кроме того, клещи Tropilaelaps способны переносить такие заболевания, как вирус деформированного крыла (DWV), и могут вызвать дополнительное снижение численности, взаимодействуя с клещами Varroa (Dainat и др. 2009, Sanpa и Chantawannakul 2009). Инвазия клещей Tropilaelaps в США или Европе, вероятно, увеличит как экономические потери, так и ухудшение здоровья медоносных пчел (DEFRA 2005). Таким образом, очень важно разработать эффективный метод исследования клещей Tropilaelaps для раннего обнаружения после потенциальной интродукции в регионы за пределами естественного ареала клещей в Азии.

Клещи Tropilaelaps являются эктопаразитами медоносных пчел, которые питаются преимущественно развивающимися пчелами (пчелиным расплодом, включая личиночную и куколочную стадии). Паразитизм этих клещей может вызвать гибель расплода и упадок колонии (Ritter 2008). Родственные виды Tropilaelaps clareae Delfinado and Baker и Tropilaelaps mercedesae Anderson and Morgan (далее совместно называемые клещами Tropilaelaps) расширили круг своих естественных хозяев, включив европейскую медоносную пчелу в дополнение к гигантской медоносной пчеле (Apis dorsata F.) после того, как первая была завезена в Азию (Anderson and Morgan 2007). Эти клещи представляют собой серьезную угрозу для управляемых европейских медоносных пчел (Anderson and Morgan 2007). Клещи Tropilaelaps имеют более высокую скорость размножения и более короткий жизненный цикл, чем клещи Varroa; таким образом, они могут конкурировать с клещами Varroa, когда присутствуют оба клеща (Burgett et al. 1983, Ritter and Schneider-Ritter 1988). Такое быстрое размножение и недавнее географическое распространение делают клещей Tropilaelaps новой угрозой для управляемых медоносных пчел во всем мире (Sammataro et al. 2000, Ritter 2008).

Министерство сельского хозяйства США — Служба инспекции здоровья животных и растений (USDA-APHIS) не разрешает импорт пчел из других стран, в которых имеются болезни, паразиты или вредители пчел, не встречающиеся в США, включая те, где известны клещи Tropilaelaps. Учитывая серьезную угрозу, которую эти клещи представляют для индустрии пчеловодства, важно не только обеспечить соблюдение законов, направленных на предотвращение распространения клещей в стране, но и иметь систему надзора, чтобы быстро выявить любой завоз и уничтожить его. Ранее было описано несколько методов отбора проб клещей Tropilaelaps, включая использование липких досок, валика с эфиром или сахаром и визуальный осмотр выводковых клеток (Ritter and Schneider-Ritter 1988, Sammataro et al. 2000, Koeniger et al. 2002, Ritter 2008). Однако эти методы могут не подходить для крупномасштабного скрининга, если они недостаточно надежны в обнаружении зараженных колоний или требуют столько времени, что их нецелесообразно применять на постоянной основе (Ritter and Akratanakul 2006).

Основной целью данного исследования была разработка метода быстрого обнаружения клещей Tropilaelaps, направленного на раннее выявление инвазий клещей. Наша цель заключалась в разработке теста, который сбалансирует потребность в высокой чувствительности с ограниченными ресурсами эпиднадзора. Мы протестировали ранее описанные методы, а также два новых метода, использующих технику сталкивания, на экономичность (время и усилия) и чувствительность (правильное обнаружение зараженных колоний). Цель обследований — обнаружить клещей с 95% уверенностью на пасеках, которые испытывают негативные последствия (Delaplane и Hood 1999, OIE 2012). Однако методы скрининга также должны быть быстрыми, с минимальным посещением каждой проверяемой пасеки. Здесь мы 1) описываем метод Bump для обнаружения клещей Tropilaelaps и 2) сравниваем его надежность с ранее описанными методами обнаружения. Затем мы разработаем рекомендации по эффективному обследованию пасек с помощью метода Bump.

Материалы и методы

В сентябре 2009 года мы оценили методы отбора проб и обнаружения клещей Tropilaelaps на 10 пасеках в Чиангмае, Таиланд. Пчеловоды в этом районе активно обрабатывают колонии раз в 2 недели для контроля уровня клещей Tropilaelaps и Varroa. Оба клеща являются эндемичными для этой местности (Самматаро и др. 2000, Андерсон и Морган 2007) и могут вызвать упадок колоний, если их не лечить.

Во всех колониях на каждой пасеке мы провели количественную оценку популяции взрослых пчел и расплода с точностью до 0,5 стандартных рамок расплодного гнезда, а также взяли пробы отдельных колоний на наличие или отсутствие клещей Tropilaelaps и Varroa шестью способами: метод «Капля», «Промывка», «Удар», «Рабочий расплод», «Дронный расплод» и «Удаление расплода + Удар». Методы капли, промывки, рабочего расплода и трутневого расплода в настоящее время используются для проверки наличия клещей Tropilaelaps в Азии (Ritter 2008); метод ударов был принят в Национальном обзоре вредителей и болезней медоносных пчел Министерства сельского хозяйства США (USDA-APHIS) (Rennich et al. 2011).

Метод капли

Мы помещали покрытые сеткой липкие доски (Olson Products, Inc., Medina, OH) под гребень колоний на 24 часа, а затем убирали их и подсчитывали клещей. Для обнаружения и подсчета клещей мы использовали 10-кратную лупу с подсветкой или препаровальный микроскоп.

Метод промывки

Приблизительно 300 взрослых пчел из каждой колонии были собраны и сохранены в этаноле для последующего количественного определения клещей с помощью модифицированного метода встряхивания мыльной воды (Ritter 2008), при котором мыльная вода отгоняет клещей от пчел. Этот метод в настоящее время используется для измерения зараженности клещами Варроа (Lee et al. 2010). Мы часто брали пробы с двух гребней, чтобы получить необходимое количество пчел.

Метод ударов

Всех взрослых пчел удаляли с одной гребенки, содержащей расплод, встряхивая рамку над колонией. После того как взрослые пчелы были удалены, мы сильно ударяли рамки о белый металлический поддон, ударяя одним концом рамки о край поддона, переворачивая рамку, снова ударяя рамку и повторяя процесс еще раз, всего четыре удара (Приложение «Методы» [только онлайн]). Этот процесс сгонял клещей на поверхность гребня, которых мы затем подсчитывали.

Метод рабочего расплода

После удаления взрослых пчел, как указано выше, мы визуально определяли наличие клещей, осматривая до 100 ячеек рабочего расплода (в среднем 95,6 ячеек на колонию). Мы исследовали по крайней мере две стороны одной или, при необходимости, двух рамок, выбирая рамки с ∼50% поверхности гребня в запечатанной стадии с каждой стороны. Весь исследованный расплод находился в постларвальной стадии. Этот метод требовал откупоривания ячеек путем удаления воскового покрытия пинцетом, а затем извлечения препуция или куколки для исследования с помощью перьевых ламп или налобных фонариков. Это приводило к потере удаленного расплода.

Метод трутневого расплода

Мы использовали тест обнаружения рабочего расплода на трутневом расплоде, исследуя до 20 ячеек трутневого расплода (в среднем 16,9 ячеек на колонию в колониях, содержащих трутневый расплод). Мы исследовали трутневый расплод только в колониях, содержащих скопление трутневого расплода в одной рамке, но не в колониях, где трутневый расплод был широко разбросан.

Удаление расплода + метод бугорка

После осмотра расплода мы снова ударяли рамки (по два удара с каждой стороны рамки, как при методе ударов) и подсчитывали отсеявшихся клещей. Этот метод был предназначен для определения того, раскрывает ли откупоривание ячеек и удаление расплода большее количество клещей, чем простое сбивание нетронутых рамок (как в методе сбивания).

Первоначальный сбор данных проводился на трех пасеках с 24-40 колониями на каждой. Затем мы расширили исследование еще на семь пасек, отобрав 19-22 из 21-107 колоний. Мы бессистемно (Martin and Bateson 1993) отбирали колонии, чтобы равномерно распределить отобранные колонии по каждой пасеке, и отбирали колонии независимо от активности колоний. После того, как были обследованы первые три пасеки, мы отказались от методов «капля» и «промывка». Они оказались слишком сложными (поскольку клещ маленький, рис. 1, и его легко спутать с мусором в улье, рис. 2), отнимали много времени или не позволяли предсказать наличие клеща (мытье взрослых пчел; см. также Waghchoure-Camphor и Martin 2009). Для первых трех пасек мы также отметили приблизительное время, необходимое для проведения каждого метода обнаружения (включая необходимую обработку образцов в лаборатории). Мы использовали эти записи для оценки относительного времени, необходимого для каждого теста (хотя это время будет несколько отличаться у разных инспекторов).

Для каждого метода обнаружения мы рассчитали внутрипасечную распространенность клещей Tropilaelaps и Varroa и уровень заражения. Наша терминология адаптирует стандартные определения (Margolis et al. 1982) для управляемых социальных насекомых, где «особь» может быть пчелой, колонией или пасекой. Внутрипасечная распространенность — это процент колоний, исследованных на одной пасеке, которые положительны на интересующего паразита. Уровень заражения — это любая мера общего количества клещей, обнаруженных в колонии. Сюда входит количество клещей, которые падают на липкую доску в течение 24 часов, среднее количество клещей на одну пчелу, обнаруженных в тесте Wash, количество клещей, вытесненных при ударе по рамке, и процент исследованных ячеек расплода, содержащих клещей. Чтобы оценить, показывают ли различные тесты одни и те же общие тенденции обнаружения клещей, мы искали корреляцию между тестами в показателях зараженности клещами Tropilaelaps или Varroa. Мы использовали ранговые корреляции Спирмена, поскольку показатели зараженности редко соответствуют параметрическим предположениям.

Мы рассчитали чувствительность каждого метода для выявления клещей Tropilaelaps и Varroa. Во-первых, мы классифицировали колонии как имеющие известные заражения клещами с помощью двух различных стандартов. (А) Заражение подтверждено: По крайней мере, один метод отбора проб обнаруживал клещей. Этот подход предполагает, что комбинация методов отбора проб обнаружит клещей во всех зараженных колониях. (B) Предполагается всеобщая зараженность: Мы предположили, что каждая колония на пасеке с некоторым количеством клещей заражена. Всеобщее заражение вполне вероятно, поскольку управляемые колонии в родном ареале клещей Tropilaelaps почти всегда заражаются без борьбы с клещами (Ritter and Akratanakul 2006), а частое взаимодействие между колониями медоносных пчел обеспечивает возможность межгнездовой передачи взрослых клещей (Evans and Schwarz 2011). Для каждого метода мы затем рассчитали его чувствительность как процент колоний с известной инвазией клещами, в которых он обнаружил клещей, отдельно рассчитав чувствительность со стандартами A и B и для каждого типа клещей. Значения чувствительности эквивалентны вероятности успеха (p^)
из биномиального распределения с числом наблюдений (n), равным либо числу колоний, в которых хотя бы один метод обнаружил клещей (стандарт A), либо числу протестированных колоний (стандарт B). Таким образом, мы рассчитали стандартную ошибку каждого значения чувствительности как

(vanEngelsdorp et al. 2013). В рамках каждого типа клещей и стандарта чувствительности мы сравнили значения чувствительности между методами обнаружения, используя нормальную аппроксимацию для пропорций. После этих тестов мы использовали процедуру множественных сравнений типа Тьюки, которая применяет угловое преобразование к каждой пропорции (Zar 1999), с коэффициентом ошибки 0,05 в рамках всего эксперимента.

Далее мы исследовали, является ли состояние лысого расплода надежным индикатором присутствия клещей Tropilaelaps. Местные пчеловоды считают, что лысый расплод — состояние, когда кукольные крышечки удалены и развивающиеся куколки открыты (Villegas and Villa 2006) — указывает на сильное заражение клещом Tropilaelaps. Мы отмечали наличие или отсутствие лысого расплода на каждом кадре, исследованном методами рабочего и трутневого расплода (см. рис. 3). Мы количественно оценивали внутрипапилярную распространенность и частоту появления лысого расплода. Для каждого типа клещей мы проверили связь между состоянием лысого расплода и клещей в колониях с помощью теста МакНемара, а состояние лысого расплода и степень заражения клещами Tropilaelaps в рабочем расплоде — с помощью теста Wilcoxon signed-rank. Оба теста предназначены для обработки совпадающих пар (Zar 1999). Данные о степени заражения клещами Tropilaelaps не соответствовали параметрическим предположениям. Статистический анализ проводился в программе JMP (SAS Institute Inc. 2012).

Чтобы убедиться, что выбор случайной рамки для выводка при проверке на зараженность клещом Tropilaelaps дает объективные результаты, мы измерили зараженность клещом на двух разных рамках для выводка в 140 исходных колониях, проверив 50 рабочих и до 20 ячеек трутневого расплода (личинки и куколки) на колонию. Мы сравнили долю клеток, осмотренных на каждой рамке, которые были заражены клещами (степень заражения) с помощью теста Вилкоксона с признаковым рангом. Мы также сравнили уровень заражения в клетках с личинками и предкуколками по сравнению с клетками с куколками, а также в клетках с трутнями и рабочим расплодом с помощью теста со знаковым рангом Вилкоксона. Предыдущие результаты показывают, что клещи Tropilaelaps предпочитают трутневый расплод (Burgett et al. 1983, но см. Waghchoure-Camphor and Martin 2009).

Мы использовали результаты методов рабочего расплода и трутневого расплода, чтобы определить, отличаются ли показатели заражения клещей Tropilaelaps и клещей Varroa от ожидаемых случайно. Отклонения от ожидаемой частоты совместного размножения свидетельствуют о содействии или конкуренции между этими двумя видами клещей. Мы сравнили присутствие клещей Tropilaelaps и клещей Varroa с помощью теста МакНемара, а уровень заражения клещами — с помощью теста Wilcoxon signed-rank.

Наконец, мы использовали показатели зараженности клещами Tropilaelaps и чувствительность тестов для разработки практических рекомендаций по крупномасштабному скринингу пасек с помощью нашего метода Bump. Во-первых, мы измерили, как чувствительность тестов зависит от степени заражения клещами Tropilaelaps (доля исследованных рабочих расплодных ячеек с клещами Tropilaelaps). Мы классифицировали уровень зараженности каждой колонии как наличие клещей Tropilaelaps в 0, 0,1-4,5 или >4,5% осмотренных рабочих выводковых клеток, а затем отдельно рассчитали чувствительность тестов на обнаружение (универсальное предположение о зараженности) в каждой категории. Наши относительно низкие показатели зараженности отражают тот факт, что все пчеловоды, чьи пасеки мы использовали, регулярно обрабатывают свои колонии акарицидами для предотвращения гибели колоний. Во-вторых, мы определили количество колоний, которые необходимо исследовать на пасеке для обнаружения клещей Tropilaelaps. Поскольку ложноположительные результаты при наших методах обнаружения невозможны, мы не могли использовать стандартные эпидемиологические методы (например, положительную прогностическую ценность), которые опираются на показатели ложноположительных результатов. Таким образом, мы рассчитали вероятность обнаружения клещей Tropilaelaps хотя бы в одной колонии зараженной пасеки методом Bump, предполагая, что клещи Tropilaelaps распространяются на пасеке случайным образом. Таким образом, количество зараженных колоний на пасеке соответствует биномиальному распределению (Culliney 2003) со следующими параметрами: n = количество проверенных колоний, X = количество положительных колоний из n, и p = вероятность того, что отобранная колония окажется положительной. Для положительного теста необходимо, чтобы и колония была заражена, и тест выявил это заражение, поэтому p = внутрипасечная распространенность (% колоний на пасеке, предположительно зараженных) × чувствительность теста. Таким образом, Ppos — вероятность того, что скрининг выявит хотя бы одну колонию, зараженную Tropilaelaps, при отборе n колоний на пасеке — это:

Мы использовали это уравнение (см. также vanEngelsdorp et al. 2013) и следующие значения для определения наименьшего количества колоний, которые должны быть проверены на пасеке, чтобы достичь нашей цели — обнаружить зараженную пасеку с 95% уверенностью. Ppos — это установленный нами уровень доверия 0,95. Предположение о всеобщем заражении устанавливает внутрипасечную распространенность равной единице. Мы использовали самый консервативный показатель чувствительности теста Bump — 36% при условии всеобщего заражения.

Это же уравнение можно применить к региону или зоне внутри страны, чтобы определить количество пасек, которые должны быть случайно отобраны для обнаружения хотя бы одной пасеки с клещом Tropilaelaps в начале инвазии. Здесь мы рассматриваем распространенность пасек — долю зараженных пасек в регионе. В начале инвазии это число будет очень низким. Под чувствительностью теперь понимается вероятность того, что при обследовании nколоний колоний на пасеку будет обнаружена зараженная пасека. Это значение равно Ppos сверху, или 0,95. Мы использовали это значение и несколько значений распространенности на пасеках для расчета наименьшего количества пасек, которые необходимо проверить для обнаружения инвазии клеща Tropilaelaps с 95% уверенностью.

Результаты

Результаты тестов.
В 236 исследованных колониях в среднем было 5,6 ± 0,09 рамок взрослых пчел (диапазон 2-8) и 4,4 ± 0,09 рамок расплода (1-7). Наши методы выявили заражение клещами Tropilaelaps в 74,6% колоний и 100% исследованных пасек. Внутрипасечная распространенность резко варьировала, в среднем от всего 4,8% на пасеке с тестом Wash до примерно половины или более колоний на пасеке с клещами Tropilaelaps с тестами Drop, Worker Brood, или Brood Removal + Bump (Таблица 1). Показатели зараженности клещами варьируются в зависимости от теста и поэтому не поддаются прямому сравнению. Тем не менее, все тесты обнаружили в среднем по крайней мере одного клеща Tropilaelaps на колонию, а большинство тестов обнаружили несколько клещей (Таблица 1). За некоторыми исключениями, особенно в тестах Drop и Wash, которые проводились не на всех пасеках, показатели зараженности клещами значительно коррелировали между тестами (Таблица 2). Таким образом, колония с высокой степенью заражения одним методом часто имела высокую степень заражения несколькими другими методами.

За исключением низкочувствительного метода «Дрон-расплод», наш метод «Капля» был наименее затратным по времени тестом на обнаружение (Таблица 3). Тест «Капля» потребовал двух посещений в последовательные дни на каждой пасеке. Тест «Рабочий расплод» занимал больше всего времени, поскольку требовал удаления расплода из ячеек и сканирования на наличие клещей. Тесты «Рабочий расплод», «Дронный расплод» и «Удаление расплода + удар» также требовали длительного воздействия на расплод и уничтожения расплода. При ударе по рамке с расплодом может погибнуть небольшое количество молодого незапечатанного или запечатанного (от личинок до белоглазки) расплода. Поэтому следует избегать слишком энергичного удара.

Использование метода Bump для проверки наличия клещей Tropilaelaps оказалось лучше, чем один стандартный метод обнаружения (Wash), но хуже, чем другие (Drop, Worker Brood) при обоих стандартах заражения клещами, использованных для расчета чувствительности (Таблица 1; стандарт A χ2 = 125,5, df = 5, P < 0,001; стандарт B χ2 = 174,1, df = 5, P < 0,001). Метод Drop имел самую высокую измеренную чувствительность, правильно определив 81,3% колоний, в которых было известно о заражении клещами Tropilaelaps (стандарт A). Если предполагается всеобщее заражение клещами (стандарт B), то наибольшую чувствительность (56,7%; Таблица 1) имело обследование рабочего расплода. Наименее чувствительным тестом было мытье взрослых пчел, которое выявило только 7,8% случаев с подтвержденным заражением клещами Tropilaelaps и 5,2% случаев, когда предполагалось всеобщее заражение. Бампинг перед удалением расплодных ячеек (Бамп-тест) был менее чувствительным, чем бампинг после удаления расплода при обоих предположениях (50,0 против 61,5% при известном заражении клещами Tropilaelaps, 36,3 против 49,1% при предположении всеобщего заражения).

Мы обнаружили клещей Варроа в 66,5% колоний и 100% пасек, по крайней мере, в одном из методов обнаружения. Текущий тест на наличие клещей Варроа, промывающий взрослых пчел, имел довольно низкую чувствительность (Таблица 1; стандартный A χ2 = 149,8, df = 5, P < 0,001; стандартный B χ2 = 192,5, df = 5, P < 0,001). Наш тест Bump оказался еще менее чувствительным, обнаружив только 10,3% зараженных колоний с подтвержденной инвазией и 6,5%, предполагающих всеобщую инвазию. Однако уровень заражения клещами Варроа был довольно низким в большинстве исследованных колоний (Таблица 1). Более трудоемкие или интрузивные тесты (капля, рабочий расплод и трутневый расплод) показали более высокую чувствительность, по крайней мере, при одном стандарте заражения.

Лысый расплод встречался в 62,7% колоний и в 7,3% из 23 305 исследованных рабочих клеток. Колонии с лысым расплодом в 1,3 раза чаще оказывались положительными на клещей Tropilaelaps по крайней мере при одном тесте на обнаружение, чем колонии с расплодом только рабочих (81,1 против 63,6%; тест МакНемара: χ2 = 9,3, df = 1, P = 0,002). Уровень заражения клещами Tropilaelaps был значительно выше в лысых (23,4 ± 2,5%), чем в закрытых клетках (3,9 ± 0,4%; тест Wilcoxon signed-rank: n = 141 колония, W = 2 043,0, P < 0,0001). Присутствие клещей варроа, однако, не показало никакой связи с лысым расплодом (63,5% колоний с лысым расплодом заражены, 71,6% колоний только с закрытым расплодом заражены; тест МакНемара: χ2 = 0,7, df = 1, P = 0,41).

Распределение клещей внутри колонии

Мы не обнаружили существенной разницы в зараженности в двух рамках из одной колонии (Wilcoxon signed-rank test: n = 140 колоний, W = 306,5, P = 0,18). Примерно одинаковый уровень зараженности клещами Tropilaelaps в препупальных (среднее ± SE = 5,6 ± 0,7% исследованных клеток имели клещей, n = 5 497 исследованных клеток) и куколочных (4,6 ± 0,7%, n = 17 808 клеток; n = 190 колоний, W = 548,5, P = 0,12) клетках рабочего расплода дополнительно подтверждает случайное распределение клещей Tropilaelaps в рабочем расплоде. Дронковый расплод имел более низкий уровень зараженности клещами Tropilaelaps (3,5 ± 0,9%, n = 1 474 ячейки), чем рабочий расплод (5,7 ± 0,6%, n = 22 082 ячейки; n = 98 колоний, W = — 616,5, P < 0,0001). Обратная ситуация наблюдалась при заражении клещами Варроа: рабочий расплод имел значительно более низкий уровень заражения клещами Варроа (0,4 ± 0,1%), чем трутневый расплод (5,0 ± 1,4%; n = 98 колоний, W = 300,0, P < 0,0001).

Совместное заражение клещами Tropilaelaps-Varroa

Наличие или отсутствие клещей Tropilaelaps в колонии не зависело от наличия клещей варроа (тест Макнемара: χ2 = 3,5, df = 1, P = 0,06). Однако уровень зараженности клещей в выводковых ячейках указывает на взаимодействие между видами клещей в колонии. Поскольку уровень заражения клещами Tropilaelaps в рабочем расплоде составил 4,6% зараженных клеток на колонию, а уровень заражения клещами Varroa — 0,7%, ожидаемый уровень двойного заражения составляет 0,032%. Это ниже, чем фактический уровень совместного заражения 0,1% (Wilcoxon signed-rank test: n = 230 колоний, W = -10 038,0, P < 0,0001). Это очевидное взаимодействие, когда двойные инфекции встречаются чаще, чем можно было бы предположить, было также заметно в расплоде трутней, где ожидаемый уровень совместного заражения составил 0,2%, а фактический — 0,3% (n = 96 колоний, W = -2,088.5, P < 0.0001).

Рекомендации по скринингу

Чувствительность теста заметно возрастала при более высоких показателях зараженности колоний клещами Tropilaelaps (Таблица 4). При самой высокой категории зараженности, обнаруженной на наших пасеках, тест Bump выявил почти 80% зараженных колоний. Таким образом, более крупные инвазии с большей вероятностью будут обнаружены при скрининге. На рисунке 4a показана вероятность обнаружения клещей Tropilaelaps в зависимости от интенсивности отбора проб на пасеках с различным уровнем инвазии, используя наиболее консервативное значение чувствительности Bump (0,36; Таблица 1). При всеобщей зараженности вероятность обнаружения клещей возрастает с 36% при проверке одной колонии до почти 99% при проверке 10 колоний.

Учитывая желание обнаружить заражение клещами на пасеке с 95% достоверностью и предполагая повсеместное заражение, мы рассчитали, что на каждой пасеке должно быть отобрано не менее семи колоний (рис. 4a), независимо от размера пасеки. При измеренной нами 75%-ной распространенности клещей Tropilaelaps внутри пасеки (Таблица 1, все тесты вместе), размер выборки, необходимый для обнаружения заражения, составляет 10 колоний на пасеку.

Проверив семь колоний на пасеку и предположив всеобщее заражение внутри пасеки, мы определили количество пасек, которые должны быть отобраны на региональном уровне для выявления зарождающейся инвазии (рис. 4b). Если заражен 1% пасек, то необходимо отобрать 312 случайно выбранных пасек. При пятипроцентном заражении пасек в регионе размер выборки снижается до 62 пасек. Когда заражение достигает 10% распространенности на пасеках, применение теста Bump к семи колониям на каждой из 30 пасек с вероятностью 95% позволит обнаружить инвазию. Эти цифры предполагают выборку семи колоний на пасеку. Однако в соответствии с текущими протоколами USDA-APHIS, которые были разработаны для количественной оценки нагрузки клещей Варроа, отбор проб производится для восьми колоний (Lee et al. 2010). Отбирая по восемь колоний на пасеку методом Bump, мы можем быть уверены на 97,2% в обнаружении хотя бы одной зараженной Tropilaelaps колонии на пасеку. Согласно этим протоколам, для выявления зарождающейся инвазии при распространенности в 1, 5 или 10% на пасеке, региональный отбор проб должен проверить 307, 61 или 30 пасек соответственно.

Регулирующие органы, которые не ограничены необходимостью в эффективных по времени протоколах, могут принять решение о применении высокочувствительного метода Drop. Таким образом, мы применили тот же набор расчетов, используя чувствительность метода Drop в 54,2%, предполагая всеобщее заражение на клещеположительных пасеках. Эта повышенная чувствительность уменьшает количество колоний на пасеке, которые должны быть отобраны для обнаружения заражения клещом Tropilaelaps с достоверностью 95% до четырех. При измеренной нами 75%-ной распространенности клещей Tropilaelaps внутри пасеки, метод Drop должен применяться к шести колониям на пасеку. При тестировании методом Drop четырех колоний на пасеку и допущении повсеместного заражения внутри пасеки, количество пасек в регионе, которые должны быть отобраны для обнаружения зарождающейся инвазии, такое же, как при применении метода Bump к семи колониям на пасеку. В соответствии с текущим протоколом USDA-APHIS, предусматривающим тестирование восьми колоний на пасеку, для выявления зарождающейся инвазии при распространенности инвазии в 1, 5 или 10% на пасеке, соответственно, для регионального отбора проб потребуется протестировать 299, 59 или 29 пасек методом Drop.

Обсуждение

Данное исследование было инициировано для определения быстрого метода обнаружения клещей Tropilaelaps с достоверностью 95%. Раннее обнаружение вторжения этого вредного и быстро распространяющегося вредителя медоносных пчел имеет решающее значение для предотвращения дальнейших потерь медоносных пчел и нехватки этих жизненно важных опылителей сельскохозяйственных культур. Наши результаты подтверждают, что тест «Bump» является лучшим простым методом проверки на присутствие клещей Tropilaelaps при обследовании пасек. Этот метод заключается в ударе рамки о металлический поддон и подсчете упавших клещей. Его чувствительность составила 50,0% для колоний, в которых была подтверждена зараженность клещами Tropilaelaps, и 36,3%, когда предполагалась всеобщая зараженность. Чувствительность этого теста была еще выше (79,3%) для колоний с уровнем заражения клещами Tropilaelaps 5% или чуть ниже, чем в наших колониях, обработанных акарицидами.

Хотя ежедневный сброс клещей, осмотр выводка рабочих и повторный сброс после осмотра выводка были более чувствительны, чем тест Бампа, каждый из них имеет сопутствующие проблемы, которые делают их менее осуществимыми для больших исследований. Озабоченность по поводу дифференциации этого клеща от естественного мусора в улье, время, необходимое для тщательного разделения этих двух видов (Ostiguy и Sammataro 2000), и необходимость возвращаться в ульи через 24 часа после введения липкой доски сделали тест «Капля» непрактичным для крупномасштабного скрининга. Тесты «Рабочий расплод» и «Удаление расплода + удары» требовали воздействия на расплод в течение длительного времени, что увеличивало смертность расплода во время исследования. В частности, метод «удаление расплода + удары» уничтожал расплод, против чего могут возражать пчеловоды. Этот метод также занимает больше времени, чем тест с ударом, так как расплодные ячейки откупориваются перед ударом. Тест «удаление расплода + удар» потенциально может быть использован без удаления расплода и может быть одним из способов повышения чувствительности метода удара. Нанесение удара по рамке с появившимися пчелами и, следовательно, некоторыми незакрытыми ячейками также может повысить чувствительность метода Bump. Проведение одновременно тестов с промывкой и бампингом также может повысить чувствительность, поскольку стряхивание взрослых пчел с рамок перед бампингом может привести к вытеснению клещей. Будущие исследования должны изучить эти возможности.

Наши результаты примерно согласуются с ранее опубликованными данными по внутрипасечной распространенности клещей Tropilaelaps и уровню зараженности в других азиатских странах. Внутриульевая распространенность зараженных ульев составила 86,3% в ульях китайских европейских медоносных пчел осенью (Luo et al. 2011) и 76,5% в ульях гигантских медоносных пчел из северного Таиланда (Burgett et al. 1990). Уровень заражения клещами Tropilaelaps в рабочих расплодных ячейках в нашем исследовании (4,6%) был немного ниже, чем в колониях пакистанских европейских медоносных пчел (8,1%; Waghchoure-Camphor and Martin 2009), но заметно выше, чем в ульях гигантских медоносных пчел (1,8%; Burgett et al. 1990). Разница между европейскими и гигантскими медоносными пчелами может быть обусловлена видовыми особенностями реакции на зараженные ячейки. Рабочие европейской пчелы обычно открывают ячейки и удаляют из улья больной расплод, тогда как рабочие гигантской пчелы оставляют запечатанные зараженные ячейки, что не позволяет взрослым клещам покинуть их и отложить свои яйца (Woyke et al. 2004). Кроме того, другие поведенческие реакции (Khongphinitbunjong et al. 2012) и сезонные миграции гигантских медоносных пчел приводят к длительным периодам без расплода, что может снизить уровень заражения клещами.

Состояние лысого расплода было достаточно надежным индикатором заражения клещами Tropilaelaps, но не должно использоваться как единственный метод диагностики. Лысый расплод вызывают многочисленные вредители ульев, включая клещей Варроа и личинок восковой моли (Villegas and Villa 2006). Однако более высокие показатели клещей Tropilaelaps в лысых, чем в закрытых ячейках, позволяют предположить, что метод Bump будет иметь более высокую чувствительность при использовании рамок, в которых есть хотя бы одна незакрытая ячейка. Кроме того, увеличение количества лысого расплода в улье или на пасеке должно предупредить пчеловодов о необходимости проверки на наличие клещей Tropilaelaps.

Единственной закономерностью распределения клещей в пределах колонии, которую мы обнаружили, была более высокая степень заражения клещами и внутрипасечная распространенность в рабочих, чем трутневых расплодных ячейках. Это противоречит информации, предоставляемой в настоящее время пчеловодам (например, DEFRA 2005, Ritter 2008). Учитывая это несоответствие, а также равные показатели зараженности клещами в трутневых и рабочих ячейках, обнаруженные Waghchoure-Camphor и Martin (2009), вопрос о том, предпочитают ли самки клеща Tropilaelaps откладывать яйца в рабочих или трутневых расплодных ячейках, должен быть рассмотрен заново.

Мы предположили, что все ульи являются Tropilaelaps-положительными на любой пасеке, где один улей положителен на клещей Tropilaelaps. Биология клещей и высокая измеренная распространенность клещей внутри пасеки подтверждают это предположение. Управляемые колонии европейских медоносных пчел в родном ареале клеща Tropilaelaps почти всегда заражаются без контроля клещей (Ritter и Akratanakul 2006), что указывает на частое перемещение клещей между ульями. Взрослые клещи могут покидать гнездо на кормовых пчелах и переходить на пчел из другого гнезда во время частых взаимодействий между колониями медоносных пчел (Evans and Schwarz 2011). Действительно, одновременное или последовательное посещение цветов и грабеж материалов из соседних гнезд становятся признанными важными путями передачи пчелиных патогенов (Durrer and Schmid-Hempel 1994, Lindstrom et al. 2008).

Основываясь на самых консервативных данных о чувствительности теста Bump, мы предлагаем следующий протокол наблюдения для раннего обнаружения инвазии клещей Tropilaelaps с 95% уверенностью. Во-первых, в ходе региональных или национальных исследований следует обследовать не менее семи колоний на пасеке, проверяя по одной рамке на улей, как описано в Протоколе национального исследования болезней медоносных пчел Министерства сельского хозяйства США (USDA-APHIS 2012). Текущие протоколы отбора проб в США предусматривают исследование восьми колоний на пасеку, что соответствует нашей рекомендации. Этот расчет предполагает всеобщее заражение в пределах зараженной пасеки. Наше предположение справедливо не только по биологическим причинам, описанным выше, но и потому, что колонии в недавно захваченном регионе не будут подвергаться обработке от клещей Tropilaelaps. Современные средства против клещей Varroa применяются два-три раза в год, что гораздо реже, чем каждые 2 недели, необходимые для борьбы с клещами Tropilaelaps. Во-вторых, мы рекомендуем проверить 312 (или 307 при исследовании восьми колоний на пасеку) пасек в регионе для раннего обнаружения инвазии. Международное эпизоотическое бюро (МЭБ) рекомендует, чтобы протоколы скрининга имели 95% вероятность обнаружения 1% инвазии в регионе (МЭБ 2012). Инвазии, все еще находящиеся на очень низком уровне распространенности на пасеках, потенциально можно контролировать или устранить с помощью карантинов, обследований границ и агрессивного уничтожения всех зараженных ульев. Наши результаты предоставляют информацию, необходимую для достаточного и эффективного мониторинга клещей Tropilaelaps, необходимого для предотвращения увеличения экономических и сельскохозяйственных потерь, которые могут возникнуть в результате внедрения клещей Tropilaelaps за пределы их родного ареала.

Цитируемые ссылки

1.Anderson D. L. Morgan M. J.
2007 Genetic and morphological variation of bee-parasitic Tropilaelaps mites (Acari: Laelapidae): new and re-defined species.Exp. Appl. Acarol. 43: 1–24
Google Scholar Crossref PubMed WorldCat

2.Burgett D. M. Rossignol P. A. Kitprasert C.
1990. A model of dispersion and regulation of brood mite (Tropilaelaps clareae) parasitism on the giant honeybee (Apis dorsata). Can. J. Zool. 68: 1423–1427
Google Scholar Crossref WorldCat

3.Burgett M. Akratanakul P. Morse R. A.
1983. Tropilaelaps clareae: a parasite of honeybees in south-east Asia. Bee World 64: 25–28
Google Scholar Crossref WorldCat

4.Camphor E.S.W. Hashmi A. A. Ritter W. Bowen I. D.
2005. Seasonal changes in mite (Tropilaelaps clareae) and honeybee (Apis mellifera) populations in Apistan treated and untreated colonies. Apiacta 40: 34–44
Google Scholar WorldCat

5.Culliney T. W.
2003. Survey for parasitic honey bee mites in Hawaii (Acariformes: Tarsonemidae; Prasitiformes: Laelapidae, Varroidae). Proc. Hawaii. Entomol. Soc. 36: 103–109
Google Scholar WorldCat

6.Dainat B. Ken T. Berthoud H. Neumann P.
2009. The ectoparasitic mite Tropilaelaps mercedesae (Acari, Laelapidae) as a vector of honeybee viruses. Insectes Sociaux 56: 40–43
Google Scholar Crossref WorldCat

7.DEFRA
2005.Tropilaelaps: parasitic mites of honey bees, p. 14 . Department for Environment, Food and Rural Affairs,London, United Kingdom
Google Scholar

8.Delaplane K. Hood W.
1999.Economic threshold for Varroa jacobsoni Oud. in the southeastern USA. Apidologie 30: 383–395
Google Scholar Crossref WorldCat

9. Durrer S. Schmid–Hempel P.
1994. Shared use of flowers leads to horizontal pathogen transmission. Proc. R Soc. Lond. B Biol. Sci.258:299–302
Google Scholar Crossref WorldCat

10. Evans J. D. Schwarz R. S.
2011, Bees brought to their knees: microbes affecting honey bee health. Trends Microbiol. 19:614–620.
Google Scholar Crossref PubMed WorldCat

11.Khongphinitbunjong K. de Guzman L. Burgett M. Rinderer T. Chantawannakul P.
2012. Behavioral responses underpinning resistance and susceptibility of honeybees to Tropilaelaps mercedesae. Apidologie 43:590–599
Google Scholar Crossref WorldCat

12.Koeniger G. Koeniger N. Anderson D. L. Lekprayoon C. Tingek S.
2002. Mites from debris and sealed brood cells of Apis dorsata colonies in Sabah (Borneo) Malaysia, including a new haplotype of Varroa jacobsoni. Apidologie 33:15–24
Google Scholar Crossref WorldCat

13. Lee K. Moon R. Burkness E. Hutchison W. Spivak M
2010. Practical sampling plans for Varroa destructor (Acari: Varroidae) in Apis mellifera (Hymenoptera: Apidae) colonies and apiaries. J. Econ. Entomol. 103 :1039–1050

Google Scholar Crossref PubMed WorldCat

14. Lindstrom A. Korpela S. Fries I. 
2008. Horizontal transmission of Paenibacillus larvae spores between honey bee (Apis mellifera) colonies through robbing. Apidologie 39: 515–522
Google Scholar Crossref WorldCat

15. Luo Q.-H. Zhou T. Dai P.-L. Song H.-L. Wu Y.-Y. Wang Q.
2011. Prevalence, intensity and associated factor analysis of Tropilaelaps mercedesae infesting Apis mellifera in China. Exp. Appl. Acarol. 55:135–146
Google Scholar Crossref PubMed WorldCat

16. Margolis L. Esch G. W. Holmes J. C. Kuris A. M. Schad G. A.
1982. The use of ecological terms in parasitology (report of an ad hoc committee of the American Society of Parasitologists). J. Parasitol. 68:131-133
Google Scholar Crossref WorldCat

17. Martin P. Bateson P.
1993. Measuring behaviour: an introductory guide , 2nd ed. Cambridge University Press, New York, NY
Google Scholar Crossref Google Preview WorldCat COPAC

18. NRC. 
2006. Status of pollinators in North America. National Academy of Sciences, Washington, DC.
Google Scholar Google Preview WorldCat COPAC

19. OIE
2012. Terrestrial animal health code. International Office of Epizootics, Paris, France
Google Scholar Google Preview WorldCat COPAC

20. Ostiguy N. Sammataro D.
2000. A simplified technique for counting Varroa jacobsoni Oud. on sticky boards. Apidologie 31: 707–716
Google Scholar Crossref WorldCat

21. Rennich K. Pettis J. vanEngelsdorp D. Hayes J. Andre M. Snyder R. Roccasecca K. Rice N. Evans J. Lopez D. et al. . 
2011. 2010–2011 National Honey Bee Pests and Diseases Survey Report, pp.14. http://www.aphis.usda.gov/plant_health/plant_pest_info/honey_bees/downloads/2010–2011_Limited_Survey_Report.pdf.

22. Ritter W.
2008.Tropilaelaps infestation of honey bees (Tropilaelaps spp.), pp. 419–423. In OIE Biological Standard Commission (ed.), Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. World Organisation for Animal Health, Paris, France.
Google Scholar Google Preview WorldCat COPAC

23. Ritter W. Akratanakul P. .
2006. Honey bee diseases and pests: a practical guide. Agricultural and Food Engineering Technical Report. FAO,Rome, Italy
Google Scholar Google Preview WorldCat COPAC

24. Ritter W. Schneider–Ritter U.
1988. Differences in biology and means of controlling Varroa jacobsoni and Tropilaelaps clareae, two novel parasitic mites of Apis mellifera, pp. 387–395. In Needham G. R. Page R.E.J. Delfinado–Baker M. Bowman C. E. (eds.), Africanized Honey Bees and Bee Mites . Ellis Horwood Ltd., Chichester, England, United Kingdom.
Google Scholar Google Preview WorldCat COPAC

25. Rosenkranz P. Aumeier P. Ziegelmann B.
2010. Biology and control of Varroa destructor. J. Invertebr. Pathol. 103: S96–S119.
Google Scholar Crossref PubMed WorldCat

26. Sammataro D. Gerson U. Needham G.
2000.Parasitic mites of honey bees: life history, implications, and impact. Annu. Rev. Entomol. 45: 519–548
Google Scholar Crossref PubMed WorldCat

27. Sanpa S. Chantawannakul P.
2009.Survey of six bee viruses using RT-PCR in Northern Thailand . J. Invertebr. Pathol. 100: 116 – 119
Google Scholar Crossref PubMed WorldCat

28. SAS Institute
2012. Using JMP 10. SAS Institute, Cary, NC
Google Scholar Google Preview WorldCat COPAC

29. USDA–APHIS. 2012. Protocol for National Honey Bee Disease Survey. http://www.aphis.usda.gov/plant_health/plant_pest_info/honey_bees/downloads/sampling-protocol.pdf.

30. vanEngelsdorp D. Meixner M. D.
2010. A historical review of managed honey bee populations in Europe and the United States and the factors that may affect them. J. Invertebr. Pathol. 103: S80–S95
Google Scholar Crossref PubMed WorldCat

31.vanEngelsdorp D. Caron D. Hayes J. Underwood R. Henson M. Rennich K. Spleen A. Andree M. Snyder R. Lee K. et al. 
2012. A national survey of managed honey bee 2010–2011 winter colony losses in the USA: results from the Bee Informed Partnership. Apicultural Res. 51:115–124
Google Scholar Crossref WorldCat

32. vanEngelsdorp D. Lengerich E. Spleen A. Dainat B. Cresswell J. Baylis K. Nguyen K. B. Soroker V. Underwood R. Human H. et al. . 
2013. Standard epidemiological methods to understand and improve Apis mellifera health. In Dietemann V. Ellis J. D. Neumann P. (eds.), The COLOSS BEEBOOK: Volume II: Standard Methods for Apis mellifera Pest and Pathogen Research. J. Apicultural Res. 52:1–16
Google Scholar WorldCat

33. vanEngelsdorp D. Hayes J. Underwood R. M. Pettis J.
2008. A survey of honey bee colony losses in the US, fall 2007 to spring 2008. PLoS ONE 3:e4071
Google Scholar Crossref PubMed WorldCat

34. vanEngelsdorp D. Hayes J.Underwood R. M. Pettis J. S.
2010. A survey of honey bee colony losses in the United States, fall 2008 to spring 2009. J. Apicultural Res. 49: 7–14.
Google Scholar Crossref WorldCat

35. vanEngelsdorp D. Hayes J. Underwood R. M. Caron D. Pettis J.
2011. A survey of managed honey bee colony losses in the USA, fall 2009 to winter 2010. J. Apicultural Res. 50:1–10
Google Scholar Crossref WorldCat

36. Villegas A. J. Villa J. D.
2006. Uncapping of pupal cells by European bees in the United States as responses to Varroa destructor and Galleria metionella. J. Apicultural Res. 45: 203–206

37. Waghchoure–Camphor E. S. Martin S. J.
2009.Population changes of Tropilaelaps clareae mites in Apis mellifera colonies in Pakistan . J. Apicultural Res. 48: 46–49
Google Scholar Crossref WorldCat

38. Woyke J. Wilde J. Reddy C. C.
2004 .Open-air-nesting honey bees Apis dorsata and Apis laboriosa differ form the cavity-nesting Apis mellifera and Apis cerana in brood hygiene behaviour. J. Invertebr. Pathol. 86:1–6
Google Scholar Crossref PubMed WorldCat

39. Zar J. H.
1999. Biostatistical analysis , 4th ed. Prentice Hall, Upper Saddle River, NJ
Google Scholar Google Preview WorldCat COPAC