Кратковременное пребывание в полуестественной среде обитания смягчает микробный дисбаланс в улье медоносной пчелы, вызванный сельскохозяйственным стрессом

Аннотация

Здоровье медоносной пчелы и микробиота кишечника этого вида взаимосвязаны. Также следует отметить наличие множества ниш в ульях, каждая из которых имеет свою микробиоту и все они сосуществуют, что мы назвали «апибиомом». Внешние стрессоры (например, антропогенизация) могут нарушить микробный баланс и устойчивость пчел. Мы предположили, что (1) бактериальные сообщества ульев, расположенных в районах с разной степенью антропотизации, отличаются по составу, и (2) из-за взаимодействия между несколькими микробиомами в рамках апибиома, изменения в сообществе одной ниши повлияют на бактерии, присутствующие в других отделах улья. Мы охарактеризовали бактериальные консорциумы различных ниш (кишечник пчел, пчелиный хлеб, вход в улей и внутренний воздух улья) 43 ульев из трех различных сред (сельскохозяйственной, полуестественной и естественной) с помощью секвенирования ампликонов 16S рРНК. Сельскохозяйственные образцы показали более низкую равномерность сообщества, истощение полезных бактерий и повышенное привлечение путей, связанных со стрессом (предсказано с помощью PICRUSt2). Таксономический и функциональный состав кишечника и входа в улей соответствовал экологическому градиенту. Arsenophonus оказался возможным индикатором антропотизации, его численность постепенно снижалась от сельского хозяйства к естественной среде во многих нишах. Важно отметить, что после 16 дней пребывания в полуестественном ландшафте ульи показали промежуточные профили, что позволяет предположить ослабление микробного дисбиоза за счет уменьшения антропотизации.

Введение

Западная медоносная пчела (Apis mellifera) находится под угрозой (1,2) из-за многочисленных стрессовых факторов, включая, помимо прочего, плохое питание, пестициды и патогены (3). Хотя эти стрессоры не уникальны для сельскохозяйственных районов, они типичны для антропогенных земель (т.е. территорий, находящихся под влиянием человека), где осуществляется большинство пчеловодческих практик. Таким образом, антропогенные территории являются идеальным местом для изучения дисбиоза микробиоты медоносной пчелы и ее восстановления. Микробное царство, связанное с медоносными пчелами и их ульями, необходимо для поддержания гомеостаза хозяина и сообщества (4,5), а иммунный ответ хозяина неразрывно связан с микробиотой кишечника (4,6). Симбиотические взаимодействия между микробиотой кишечника и пчелами могут быть высокоспециализированными, при этом некоторые бактерии и грибы предотвращают колонизацию патогенов, очищают токсичные метаболиты или метаболизируют вещества, недоступные для пчел (4,6,7,8,9,10,11,12). Микробиота кишечника рабочих пчел состоит из 8-10 видов бактерий (13) и может быть нарушена внешними микробами, недостатком питательных веществ или химикатами (14,15,16), причем последние наносят вред пчелам на всех стадиях развития (17,18,19,20). Дисбиоз кишечной флоры может подорвать устойчивость медоносных пчел и вызвать начало болезни, в то время как положительное подкрепление вызывает восстановление полезных микроорганизмов и укрепляет здоровье хозяина (6). Восстановление основной микробиоты может быть достигнуто с помощью пробиотических добавок для основных бактерий кишечника (21). Однако нет единого мнения о причинах дисбиоза микробиоты кишечника, его регуляции и восстановлении, а также о том, как он влияет на другие микробные сообщества улья (и как на них влияют).

Внутри улья сосуществуют многочисленные микросреды или ниши (например, запасы пищи), каждая со своей уникальной микробиотой, вместе с пчелами и их кишечником. Микробиоты этих ниш неизолированы и могут претерпевать изменения при столкновении с другими микробными сообществами или стрессовыми факторами. Среда обитания и рацион пчел также могут влиять на некоторые из этих нишевых сообществ, как это видно на примере пыльцы коробочных пчел (22) и пчелиного хлеба, где состав микробного сообщества меняется от первоначальных экологических профилей в сторону сообществ, специфичных для пчелиного хлеба (23). Не менее важно учитывать влияние стрессовых факторов, среды обитания и рациона в других нишах, таких как воздушные частицы или поверхности ульев. Пестициды не только непосредственно влияют на медоносных пчел, но и могут накапливаться до опасных концентраций в компонентах улья (20,24), нарушая микробиоту этих ниш и ослабляя колонии (18). Социальные взаимодействия между интегрантами колонии также могут способствовать распространению микробов внутри ульев (25), как это наблюдается в случае с родом Arsenophonus (26), или способствовать межколониальной передаче патогенов (27,28). Из-за тесной взаимосвязи между пчелами, колонией и компонентами улья, дисбиоз микробиоты ниши улья, вызванный стрессом, может передаваться микробиоте кишечника медоносной пчелы. Действительно, Андерсон и др. (29) обнаружили специфические для кишечника бактерии в образцах ульев, что свидетельствует о бактериальной передаче между желудочно-кишечным трактом медоносной пчелы и внутренней микросредой улья. Мы предлагаем одновременное изучение нескольких специфических микробиоты ниши, чтобы лучше понять их роль в этой взаимосвязи между ульями и пчелами. Мы вводим термин «апибиом» для обозначения микробного сообщества, сформированного всеми нишами улья, включая пчел.

Здесь мы охарактеризовали бактериальные консорциумы в полевых условиях и прогностический функциональный профиль бактериальной фракции апибиомы, особенно в кишечнике медоносной пчелы, пчелином хлебе, входе в улей и внутреннем воздухе улья, в ульях в контрастных условиях окружающей среды с помощью секвенирования ампликонов V4 16S рРНК Illumina. Функциональная характеристика была выполнена с помощью предиктивной программы PICRUSt2. Основываясь на результатах, полученных Муньос-Колменеро и др. (30), где сравнивались контрастные антропогенные среды обитания, мы ожидали, что более высокий уровень антропотизации приведет к увеличению количества условно-патогенных/патогенных бактерий и истощению полезных бактерий, в то время как более низкий уровень антропотизации приведет к более сбалансированной микробиоте кишечника. Исследуемые контрастные среды состояли из сельскохозяйственной, полуестественной и природной территорий. Сельскохозяйственные и полуестественные районы содержали недавно образованные колонии одного происхождения, в то время как колонии, расположенные на естественной территории, выжили в течение 10 лет без вмешательства человека и сохранили толерантность к присутствию инфекций Varroa destructor. Насколько нам известно, это первое исследование, проверяющее влияние антропогенеза на несколько микробиомов улья (т.е. апибиома).

Результаты

Измерение характеристик силы колонии и нагрузки Varroa destructor

Ульи, расположенные на естественной территории (далее — естественные ульи или колонии), имели наибольший вес (вес улья, тест Kruskal-Wallis, p < 0,0001) (рис. 1a) и наименьшую популяцию пчел (тест ANOVA, p < 0,0001) (рис. 1d), исключая одну колонию с более высокой нагрузкой пчел (т.е. выброс). Пыльца почти отсутствовала в ульях, расположенных в полуестественной зоне (т.е. полуестественные ульи или колонии), по сравнению с богатыми пыльцой сельскохозяйственными (далее сельскохозяйственные ульи или колонии) и естественными колониями (парный тест Данна, p < 0,0001) (рис. 1b). Наличие расплода было самым высоким в сельском хозяйстве (тест ANOVA, p < 0,0001) и очень схожим в естественной и полуестественной среде (парный тест Тьюки, p > 0,05) (рис. 1e). Средняя нагрузка варроа была нулевой и одинаковой на всех пасеках (тест Kruskal-Wallis, p > 0,05), но две природные колонии имели высокую нагрузку клещей (рис. 1c).

Сравнение богатства бактериальных сообществ и таксономического состава между нишами ульев

В целом, 158 образцов были адекватно амплифицированы и секвенированы. После сборки парных последовательностей, фильтрации качества и удаления синглетов наш окончательный набор данных состоял из 7 962 468 прочтений. Общая частота считываний составила 4 040 931 для кишечника (среднее = 93 975,139 ± 29 760), 1 089 501 для пчелиного хлеба (среднее = 26 573,195 ± 13 298), 2 471 615 для входа в улей (среднее = 58 847,976 ± 19 523) и 360 421 для внутреннего воздуха (среднее = 11 263,156 ± 9 867).

Ниша улья оказала значительное влияние на биоразнообразие бактериального сообщества (филогенетическое разнообразие, PD), индекс разнообразия Шеннона (H) и индекс равномерности Пиелоу (J′) (Kruskal-Wallis p < 0,0001). Образцы кишечника представили наименее разнообразный (самые низкие PD и H, p < 0,0001), но наиболее равномерно распределенный бактериальный микробиом из всех типов образцов (самый высокий J′ p < 0,05) (Дополнительный рис. S1).

Протеобактерии были самыми многочисленными таксонами (рис. 2a), причем наиболее многочисленным классом (во всех нишах, кроме кишечника) были альфапротеобактерии, за ними следовали гаммапротеобактерии, бациллы и актинобактерии (рис. 2b). Образцы воздуха внутренних ульев были переполнены альфапротеобактериями [86%, представленными родами Sphingomonas (54,9%), Methylobacterium (13,2%), Bradyrhizobium (2,66%) и Phyllobacterium (1. 82%)] (рис. 2c, дополнительный рис. S2), и только классы Gammaproteobacteria (5,66%), Bacilli (2,2%) и Actinobacteria (1,4%) имели относительное обилие более 1% (рис. 2b). Микробиота пчелиного хлеба была богата семействами Acidobacteria (0,83%), Verrucomicrobiae (0,80%), Thermoleophilia (0,69%) и Oxynphotobacteria (0,27%) (рис. 2b), а Methylobacterium (15. 06%), Acinetobacter (6,79%) и Pseudomonas (1,06%), а также сходное обилие Sphingomonas, Bradyrhizobium и Phyllobacterium с образцами воздуха (рис. 2c, дополнительный рис. S2). Вход в улей представлял наибольшее относительное обилие семейств Actinobacteria (6,81%), Bacteroidia (3,69%) и Blastocatellia (0,21%) среди всех ниш улья, а также неизвестных бактерий (2,92%) (рис. 2b) и родов Arsenophonus (15,64%), Curtobacterium (1,81%) и Hymenobacter (1,21%) (рис. 2c, дополнительный рис. S2). Состав бактериального микробиома образцов кишечника был перекошен в сторону присутствия класса Gammaproteobacteria (55,7%) и филума Firmicutes (31,47% Bacilli), и был богат классами с относительной численностью < 0,1% (рис. 2b). На уровне родов более 70% микробиома кишечника составляли представители родов Gilliamella, Lactobacillus и Snodgrasella (рис. 2c, дополнительный рис. S2).

Экологическое и антропогенное воздействие на разнообразие в различных нишах улья

Микробные сообщества в целом были более равномерно представлены в естественной среде (индекс Пиелоу, тест Kruskal-Wallis, p < 0,05 для кишечника, p < 0,01 для входа в улей), а полуестественные образцы показали промежуточные значения (Дополнительный рис. S3a). Филогенетическое разнообразие изменилось для образцов входа в улей, где естественные ульи имели самые высокие значения, а антропогенные — самые низкие (Kruskal-Wallis p < 0,05) (Дополнительный рис. S3b). Также наблюдались значительные различия в разнообразии Шеннона при сравнении входов в ульи, расположенных в сельскохозяйственных и природных ландшафтах (Kruskal-Wallis p < 0,01) (Дополнительный рис. S3c).

Состав бактериального сообщества значительно отличался в зависимости от среды для образцов пчелиного хлеба, входа в улей и кишечника (PERMANOVA, p ≤ 0,01 для всех, pseudo-F > 4, 11, 14 соответственно), но не для внутреннего воздуха (Дополнительная таблица S1). Различия в сообществе пчелиного хлеба между средами были значительными, но слабыми, с небольшой кластеризацией в PCoA (Дополнительный рис. S4a) и отсутствием кластеризации в UPGMA (Дополнительный рис. S4b). Напротив, образцы входа в улей показали дифференцированный кластер, образованный природными образцами, и значительное разделение между антропогенной и полуприродной средой (парный PERMANOVA, псевдо-F = 7,63, p = 0,002) (Дополнительная таблица S1), отраженное в кластеризации сред на UPGMA, но не четко видимое в PCoA (рис. 3a). Однако неоднородная дисперсия по средам оказалась значительной (betadisper, F = 9,941, p = 0,001), причем природная группа демонстрировала внутрикомпозиционную дисперсию. Кишки рабочих также кластеризовались отдельно для природных образцов и были единственным типом образцов, демонстрирующим четкую дивергенцию микробных кладов между сельскохозяйственной и полуестественной средой (PCo2 = 12,81% и псевдо-F = 8,86, p = 0,001) (рис. 3b) (Дополнительная таблица S1). Однако наибольшее расстояние Брея-Кертиса (индекс, измеряющий несходство микробного состава между образцами) было обнаружено при сравнении антропогенных или полуприродных и природных образцов (PCo1 = 42,87% и PERMANOVA pseudo-F > 10, p = 0,001) (Дополнительная таблица S1).

Функциональные и бактериальные профили сообществ в различных средах обитания

Образцы кишечника рабочих медоносных пчел

Во всех трех средах были широко представлены Firmicutes (Lactobacillus), Gammaproteobacteria (Orbaceae Gilliamella и Frischella), Betaproteobacteria (Snodgrasella), Actinobacteria (Bifidobacterium) и Alphaproteobacteria (Bartonella, Methylobacterium, Sphingomonas и Bradyrhizobium). Однако наблюдались четкие различия между естественной и сельскохозяйственной средой. В сельскохозяйственной среде было обнаружено обогащение семейств Enterobacteriaceae (Gammaproteobacteria) и Rhizobiaceae (Alphaproteobacteria) (LDA > 3,6) (рис. 4a). Роды гаммапротеобактерий Pantoea и Arsenophonus также были обогащены в сельскохозяйственной среде по сравнению с другими средами, хотя и незначительно (Дополнительная таблица S2). Роды Lactobacillus (бациллы), Commensalibacter (альфапротеобактерии) и Snodgrasella (гаммапротеобактерии) представляли естественную среду (LDA > 4,6) (рис. 4a). Интересно, что род Gilliamella был недостаточно представлен в природных образцах, с более низкой относительной частотой, чем в двух других средах (медиана 16,94% в природных, 34,28% в полуприродных и 37,16% в сельскохозяйственных) (Дополнительная таблица S2). Полуестественные образцы характеризовались более высоким присутствием Bartonella (редкие в других средах) и Frischella (медиана 8,24% против 2,91% в сельскохозяйственных и 3,54% в природных) (Дополнительная таблица S2). В полуестественной среде обитания (рис. 4a) не было обнаружено таксонов, отличающихся по степени обогащения, но, что важно, большинство представителей сельскохозяйственной и природной среды имели промежуточное обилие в этой среде (рис. 6a).

Что касается взаимодействия бактерий с бактериями, природные представители Commensalibacter и Lactobacillus были положительно коррелированы (R = 0,50, p < 0,01). Несколько родов из семейства Enterobacteriaceae (Hafnia-Obesumbacterium, Pantoea и один не назначенный) имели высокие отрицательные корреляции с Commensalibacter (R < — 0,62, p < 0,001) и более умеренные корреляции с Bartonella (R < — 0,46, p < 0,05), которая была более многочисленна в полуестественных колониях. Другие представители семейства Enterobacteriaceae (Morganella, Serratia) показали умеренные отрицательные корреляции только с Commensalibacter (R < — 0,48, p < 0,05). В целом, бактерии Enterobacteriaceae способствовали присутствию других Enterobacteriaceae, особенно между бактериями, отрицательно коррелирующими с Commensalibacter. Два Rhizobiaceae также положительно коррелировали с несколькими Enterobacteriaceae (R > 0,4, p < 0,05). Высокие положительные корреляции также наблюдались для нескольких родов Acetobacteraceae, причем самые высокие корреляции наблюдались между Asaia против Gluconacetobacter (R = 1, p < 0,0001); и Gluconobacter против Komagataeibacter (R = 0,70, p < 0,001) (рис. 4b).

В прогностическом функциональном профиле природные и сельскохозяйственные среды представили либо самый низкий, либо самый высокий набор признаков. Полуестественные образцы в целом имели промежуточные значения, что указывает на возможный «промежуточный микробиом», обнаруженный в полуестественных образцах кишечника. Анализ сходства по PCoA показал кластеризацию сред вдоль оси PCo1 (рис. 4c). Все среды имели сходные показатели биоразнообразия, при этом сельскохозяйственные образцы имели самые высокие значения H по сравнению с естественными и полуестественными (p < 0,001), а между полуестественными и естественными образцами не было обнаружено существенных различий (Дополнительный рис. S5a). Природные образцы показали значительное привлечение нескольких анаболических реакций для образования метаболитов-предшественников, нуклеозидов и нуклеотидов, в то время как пути биосинтеза аргинина и деградации β-D-глюкуронозида были более показательны для сельскохозяйственных образцов (рис. 4d). В полуестественной среде не было обнаружено ни одного значимого пути, хотя она имела промежуточное количество для каждого обнаруженного пути, значимого для сельского хозяйства и природы.

Образцы входа в улей

Влияние окружающей среды было очевидным: только Sphingomonas, Bradyrhizobium и Methylobacterium присутствовали в изобилии во всех средах. Сельскохозяйственные и полуестественные пасеки были переполнены протеобактериями и более обогащены по сравнению с естественными образцами по Firmicutes (Lactobacillus, Staphylococcus, Streptococcus, Paenibacillus). Неестественные пасеки различались скорее по обилию бактерий, чем по их наличию/отсутствию. Гаммапротеобактерии (в основном Arsenophonus, Stenotrophomonas и Pseudomonas) были характерны для сельскохозяйственных образцов, как и Lactococcus (Firmicutes) (рис. 5a). Природные образцы имели дивергентный микробный профиль, с обилием представителей классов Actinobacteria и Bacteroidia. Роды Aureimonas и Deinococcus были значительно обогащены в этих природных колониях (LDA > 3,5) (рис. 5a), в то время как Massilia была немного обогащена (Дополнительная таблица S2), Arsenophonus отсутствовал, а Sphingomonas, Phyllobacterium и Bradyrhizobium имели в целом более низкую численность (Дополнительная таблица S3). Род Sphingomonas (LDA > 5,0), класс Bacilli, несколько родов Proteobacteria, а также филы Firmicutes, Gemmatimonadetes и Actinobacteria были наиболее значимыми для полуприродных образцов (рис. 5a). Два значимых для сельского хозяйства рода, Arsenophonus и Lactococcus, показали промежуточное обилие в полуприродных образцах (рис. 6c). В видовом отношении, Paenibacillus larvae и Lactobacillus kunkeei (оба Bacilli) плюс Corynebacterium afermentans sub. sp. afermentans (Actinobacteria) были представителями полуприродных образцов (LDA > 3,0), причем P. larvae присутствовал в природных образцах и практически отсутствовал в сельскохозяйственных ульях, а L. kunkeei и C. afermentans присутствовали в сельскохозяйственных ульях, но отсутствовали в природных ульях (Дополнительная таблица S4).

Что касается взаимодействий между бактериями, корреляции в основном группировались по таксонам. Актинобактерии и бактероиды, такие как Jatrophihabitans, Curtobacterium или Hymenobacter, способствовали взаимному присутствию и наоборот, в то время как присутствию Alphaproteobacteria способствовали различные Firmicutes (корреляция Спирмена, R > 0, p < 0,05). Исключение, отмеченное отрицательной корреляцией, было обнаружено между несколькими Actinobacteria или Bacteroidia против таких родов, как Arsenophonus, Corynebacterium 1, Micrococcus и Gaiella (рис. 5b).

В прогностическом функциональном профиле природные ульи сгруппировались вместе (объясняя 19,53% различий), в то время как сельскохозяйственные образцы рассеялись по оси PCo1 (рис. 5c). Разнообразие функциональных профилей было самым высоким в естественных ульях и самым низким в полуестественных (индекс Шеннона, p < 0,05) (Дополнительный рис. S5b). Ни одна из значительно набранных функций не была эксклюзивной для одной среды. Единственной не вездесущей функцией был биосинтез липополисахарида (ЛПС) (отсутствующий в природных колониях) (рис. 6d), хотя некоторые пути также были дефицитными в других средах (биосинтез пиримидина III в сельскохозяйственном кишечнике и биосинтез (Kdo)2-липида A в естественном входе в улей) (рис. 6b,d). В естественных колониях наблюдалась повышенная частота шунта Bifidobacterium, биосинтеза L-метионина (в основном опосредованного трансульфурацией из оксалоацетата) и цикла трикарбоновых кислот, характерного для продуцентов ацетата (цикл ТСА VII) (рис. 5d). Сельскохозяйственные ульи обладали обогащенным синтезом нуклеотидов, кофакторов, никотинамид аденин динуклеотида (NAD), мембранных компонентов (Kdo2 липид A, LPS, миколат) и жирных кислот. Путь процессинга тРНК, приводящий к активации тРНК, и строгий специфический метаболизм ppGpp также были значительно экспрессированы (рис. 5d). Полуприродные образцы имели значительный набор фермента триптофан-7-галогеназы (рис. 5e) и анаэробного биосинтеза гондоата (рис. 5d) и промежуточные значения для других путей, обогащенных в более экстремальных средах (рис. 6b,d).

Образцы пчелиного хлеба

Контрастные среды имели схожие микробиомы, различия проявлялись в основном в обилии дефицитных таксонов. Sphingomonas и Methylobacterium (Alphaproteobacteria) были самыми многочисленными родами, за ними следовали Acinetobacter в естественной среде и Bradyrhizobium в двух других (Дополнительная таблица S2). Род Bombella был обогащен в естественных ульях, Arsenophonus представлял сельскохозяйственную среду, и ни один таксон не был увеличен в полуестественных образцах (LDA > 3,0) (Дополнительный рис. S4c).

Внутренний воздух ульев

Влияние окружающей среды было незначительным для внутреннего воздуха и проявлялось только в обогащении Enterobacteriaceae (в основном Arsenophonus), Curtobacterium и Massilia в сельскохозяйственных образцах (Дополнительный рис. S6).

Промежуточные функциональные и бактериальные профили сообществ в полуестественных ульях

Результаты бета-разнообразия бактериальных сообществ кишечника и предсказанных функций показали, что полуестественные образцы кластеризуются между естественными и сельскохозяйственными ульями (рис. 3b, 4c). Этот эффект был также очевиден для предсказанных функций образцов входа в улей (рис. 3a, 5c). В соответствии с этим, полуестественные ульи показали промежуточное относительное обилие для нескольких таксонов и функциональных путей, в то время как естественные и сельскохозяйственные среды демонстрировали либо самое низкое, либо самое высокое относительное обилие (рис. 6). Эта тенденция была более очевидна на функциональном (рис. 6b,d), чем на таксономическом уровне (рис. 6a,c). Бактериальные представители, демонстрирующие промежуточное обилие в образцах кишечника, включали Comensalibacter, который был обогащен в естественных, скуден в полуестественных и в основном отсутствовал в сельскохозяйственных образцах. Неизвестный род Rhizobiaceae демонстрировал противоположную тенденцию (обогащение в сельском хозяйстве и отсутствие или почти отсутствие в природных образцах) (рис. 6а). Такая же картина наблюдалась для Lactococcus во входе в улей (рис. 6b) и Arsenophonus во входе в улей (рис. 6b), пчелином хлебе (рис. 6e) и образцах кишечника (Дополнительная таблица S2). Менее выраженный переход был обнаружен для Lactobacillus в образцах кишечника и Pseudomonas во входе в улей. Оба вида присутствовали во всех средах, но их количество увеличилось в естественных и сельскохозяйственных средах, соответственно, в то время как в полуестественной среде их количество было промежуточным. Образцы пчелиного хлеба и кишечника также показали общее промежуточное обилие некоторых бактерий, не имеющих отношения к окружающей среде, таких как Bradyrhizobium в пчелином хлебе и Gilliamella в кишечнике (Дополнительная таблица S2). Помимо вышеупомянутых бактерий, демонстрирующих промежуточное обилие, все значительно рекрутированные функции в образцах из кишечника и входа в улей имели наибольшее или наименьшее обилие в естественных и сельскохозяйственных колониях, и промежуточные значения в полуестественной среде (рис. 6b,d). Это поведение было четко выражено в сельскохозяйственном наборе NAD и синтезе Kdo2-липида A, оба из которых демонстрировали относительное среднее обилие менее 0,001% в естественных колониях (рис. 6d). Исключением из правила были анаэробный синтез гондоатов, обогащенный в полуестественном входе в улей, и шунт Bifidobacterium с одинаково низкой относительной численностью в обоих антропогенных местах (рис. 6d).

Обсуждение

Несколько исследований выявили вызванные антропогенизацией бактериальные сдвиги в микробиоте кишечника медоносной пчелы (14,16,17,19,30), нарушающие численность, состав и функции микроорганизмов кишечника. В данном исследовании антропогенизация окружающей среды привела к обогащению потенциальными патогенами и бактериями, способными выживать в загрязненных ландшафтах, а также к привлечению функциональных путей, связанных со стрессовой реакцией, в образцы кишечника пчел и входа в улей. Важно отметить, что полуестественные ульи, несмотря на то, что генетически идентичны сельскохозяйственным (сформированы из пчел того же происхождения, маток и запасов корма), но не связаны с естественными, показали промежуточные значения на таксономическом и функциональном уровнях. Такое смешение сельскохозяйственных и природных признаков, вероятно, обусловлено факторами окружающей среды (например, разнообразием пыльцы или загрязнением).

В целом, бактериальные сообщества, связанные с естественными ульями, не отличались от ожидаемого профиля ядра для образцов кишечника (13) , и были посвящены выполнению основных функций. Бактерии, адаптированные к естественной среде, были обнаружены в основном у входа в улей. Эти естественные ульи были тяжелее, но менее населены, чем неестественные ульи. Уменьшение размеров колоний было связано с колониями, выжившими от Варроа (31).

Кишечник рабочих из естественной среды демонстрировал бактериальный профиль, ассоциирующийся с хорошим здоровьем, и был обогащен Acetobacteraceae и членами ядра кишечника Snodgrasella, Lactobacillus и Commensalibacter (участвующими в получении питательных веществ и иммунных реакциях). Обогащение Acetobacteraceae и Lactobacillaceae было связано с пасеками, расположенными на расстоянии > 1 км от посевов (14), а обогащение Commensalibacter было связано с естественными условиями окружающей среды (30), зимовкой медоносных пчел (32) и устойчивостью против европейской плодожорки (28). Некоторые лактобациллы являются основными членами микробиома кишечника медоносной пчелы, ферментируют побочные продукты пчелиного рациона (9,10,11) и могут подавлять патоген Paenibacillus larvae в кишечнике личинок (7). Интересно, что Paenibacillus присутствовал на естественной пасеке в низких количествах во всех апибиомах, за исключением пчелиного хлеба, где его количество было равно количеству, обнаруженному в сельскохозяйственных образцах. Личинки P. larvae также присутствовали в образцах естественного входа в улей, однако клинических симптомов американской плодожорки не наблюдалось, что говорит об инактивации спор или подавлении патогена бактериальным сообществом кишечника пчел. Обеднение Lactobacillus (как это было обнаружено в наших сельскохозяйственных ульях) было выявлено после применения антибиотиков (33). Snodgrasella также способствует улучшению равновесия в кишечнике медоносной пчелы, способствуя образованию биопленки в кишечнике (34), поддерживая анаэробиоз для симбионтов кишечника (9) и экспрессируя иммунные гены после заражения кишечной палочкой (35). Ранее предполагалось, что ингибирование протозоанов в естественном кишечнике медоносной пчелы путем комбинированного обогащения Lactobacillus, Commensalibacter и Snodgrasella является вероятным (30), и известно, что это происходит у шмелей (36). Последовательно, Commensalibater и Lactobacillus положительно коррелировали в нашем исследовании и были доминирующими в естественной среде. В целом, консорциум родов, обнаруженный в кишечнике природных колоний, поддерживал гомеостаз кишечной среды (анаэробиоз и биопленки) и, возможно, препятствовал инфекционным или оппортунистическим колонизациям, поддерживая благополучие медоносной пчелы как за счет подавления патогенных инфекций или их переносимости (например, P. larvae), так и за счет благоприятного потребления важных молекул и питательных веществ. В совокупности этот естественный таксономический профиль представляет собой сбалансированный микробиом медоносной пчелы. Напротив, бактериальные сообщества кишечника сельскохозяйственных пчел были обогащены неосновными бактериями, что совпадает с результатами исследований Муньоса-Колменеро и др. (30), которые также утверждают, что антропогенные факторы могут привести к микробным сдвигам и благоприятствовать распространению условно-патогенных бактерий. В кишечнике сельскохозяйственных животных было много Enterobacteriaceae и Rhizobiaceae, оба вида связаны с антропогенизацией, причем Rhizobiaceae были связаны с кормлением сахарным сиропом (15) , а Enterobacteriaceae — с использованием пестицидов Coumaphos и Chlorothalonil (18) , а также с антропогенизацией (30). Некоторые виды Enterobacteriaceae также являются оппортунистическими бактериями окружающей среды, и их присутствие в кишечнике медоносных пчел было связано с ослаблением здоровья колонии (37) и болезнями (38). Различные виды Enterobacteriaceae в наших образцах отрицательно коррелировали с Commensalibacter и Bartonella. Увеличение количества Bartonella было обнаружено у зимних пчел (32) и у недавно появившихся пчел после пищевого стресса и заражения Nosema ceranae (16). Таким образом, в то время как Commensalibacter поддерживали гомеостаз естественных бактериальных сообществ, Bartonella могла выполнять аналогичную функцию в полуестественных колониях.

В целом, обогащение условно-патогенных бактерий и сокращение полезных таксонов было очевидным в сельскохозяйственных колониях, что подтверждает пагубное влияние антропотизации окружающей среды. Между двумя крайностями, полуприродные профили смещались в сторону природных сообществ, несмотря на генетическое сходство и географическую близость к сельскохозяйственным колониям. Совокупное снижение количества Enterobacteraceae и обогащение полезными Commensalibacter и Lactobacillus (природные > полуприродные > сельскохозяйственные) способствовало снижению антропотизации и более сбалансированному состоянию полуприродных колоний.

Бактерии кишечника медоносной пчелы демонстрируют сниженный метаболизм (39) , специализирующийся на использовании рекальцифицированных соединений (сахаров, флавоноидных гликозидов и т.д.), получаемых из рациона пчел (11). В этом смысле большинство микроорганизмов в кишечнике осуществляют анаэробную углеводную ферментацию (11,39), а некоторые участвуют в образовании биопленок или клеточной адгезии, такие как Gilliamella apicola, Snodgrasella alvi, Lactobacillus и Bifidobacterium (12,39). В соответствии с этим, природная среда демонстрировала присущий ей метаболизм, поддерживающий синтез необходимых метаболитов (UMP и пиримидиновые дезоксирибонуклеотиды) и привлечение вездесущих анаболических реакций (неокислительная ветвь пентозофосфатного пути, PPP). Эти неотъемлемые пути, обедненные в сельскохозяйственных кишках, показали промежуточное пополнение в полуестественных образцах, что свидетельствует об ослабленном метаболизме в обоих антропогенных местах. Синтез пиримидина был особенно низким в сельском хозяйстве, что может отражать снижение численности Lactobacillus в этом месте, поскольку Lactobacillus синтезируют исключительно пиримидин (11). В сочетании с менее активным анаболизмом, сельскохозяйственные образцы демонстрировали пути, связанные со стрессом. В них наблюдался повышенный биосинтез аргинина (Arg), связанный с последствиями холодового стресса у диптеры Bactrocera dorsalis (40), и повышенная деградация β-D-глюкуронозидов. Глюкуронозиды образуются у млекопитающих как побочные продукты печеночного глюкуронирования, обеспечивая детоксикацию нежелательных и токсичных соединений (41) , и затем выводятся в кишечник. Распад β-D-глюкуронозида в кишечнике пчел предполагает наличие глюкуронозида после глюкуронидирования токсичных молекул медоносными пчелами. Присутствие ксенобиотиков может заставить микробиом кишечных бактерий вкладывать большую часть своей энергии в защитные механизмы, таким образом, пренебрегая путями, необходимыми для процветания сообщества (т.е. функциями, наблюдаемыми в естественных кишечниках). Сельскохозяйственные медоносные пчелы выживают в таких условиях, но не могут достичь здорового состояния.

Помимо кишечника медоносной пчелы, другие ниши в апибиоме также продемонстрировали сильное воздействие на окружающую среду. Вход в улей, находящийся в непосредственном контакте с внешней зоной улья, оказался ценным индикатором ландшафта. Прибрежное расположение природных колоний (на острове Уния) способствовало обогащению в основном водными и солеустойчивыми бактериями. Бактероиды, например, часто усиливаются в галощелочных средах обитания (42) , таких как наша естественная береговая линия (т.е. высокая соленость и влажность). Более важным для нашего исследования было снижение присутствия устойчивых к загрязнению Sphingomonas (43) и потенциального патогена Arsenophonus (37,38). Бактерии, которыми обогащены сельскохозяйственные и полуестественные ландшафты, распространены в средах, связанных с растениями (например, в почве и корнях). Устойчивость некоторых из этих бактерий к загрязнению окружающей среды была зарегистрирована или предполагается. Gammaproteobacteria, обогащенные в сельскохозяйственных колониях, являются высокоадаптивными хемотрофами, которые, как предполагается, могут противостоять неблагоприятным условиям (42), в то время как роды Sphingomonas и Gemmatimonas в полуестественных ульях (обогащенные и присутствующие соответственно) являются ключевыми бактериями в загрязненных кадмием и подверженных солевому и щелочному стрессу почвах (42). Увеличение численности Gemmatimonas также было связано с применением фунгицида пираклостробина (44) и длительным использованием органических и неорганических удобрений (45). Sphingomonas часто ассоциируются с растительными микробиомами, способны разлагать несколько рекальцитантных веществ и являются общими помощниками грибов и растений в процессе деградации металлов в почве (43,46). Сообщалось о распространении Sphingomonas в микробиомах листьев после антипатогенной обработки растений (47). Об обогащении Sphingomonas, аналогичном тому, которое наблюдается в полуестественных ульях, сообщалось в отношении почв, загрязненных нефтью (48). Действительно, полуестественные и сельскохозяйственные пасеки были расположены вблизи традиционных нефтяных и газовых месторождений (49).

Обогащение потенциальными патогенами было еще одной общей чертой полуестественных и сельскохозяйственных ульев. Сельскохозяйственные образцы были особенно обогащены Pseudomonas (50) и Arsenophonus. У пчел Arsenophonus был связан с повышенной смертностью (26) и ослаблением здоровья колонии (37), а обогащение одним из кандидатов Arsenophonus было связано с увеличением случаев распада колонии (38). Интересно, что одно исследование показало, что как окружающая среда, так и социальные взаимодействия играют важную роль в приобретении Arsenophonus медоносной пчелой (26), и Arsenophonus был обогащен во всех сельскохозяйственных нишах ульев. Арсенофонтус может быть биомаркером антропизации, передающимся через социальную деятельность. Однако то же исследование (26) показало, что численность Arsenophonus в кишечнике медоносной пчелы очень зависит от местоположения, причем в соседних ульях его численность была одинаковой. Таким образом, мы не можем исключить влияние пасеки на различия, обнаруженные в количестве Arsenophonus. В полуестественных ульях также было обнаружено несколько потенциальных патогенов медоносной пчелы, включая поражающие человека Streptococcus (51), Anaerococcus (52) и Paenibacillus. Последний род представляет большую опасность для медоносных пчел, поскольку личинки Paenibacillus являются возбудителем американской плодожорки (AFB) (53). Если Paenibacillus передается от входа к пчелам, он может заразить расплод и создать угрозу для полуестественных колоний. Аналогичным образом, Lactobacillus kunkeei, присутствующий в этих полуестественных ульях, если он передастся расплоду, может защитить полуестественные колонии, повысив устойчивость расплода к личинкам P. и Nosema ceranae (7,54). Для определения передачи личинок P. larvae внутри ульев потребуются дальнейшие исследования. Напротив, входы в ульи естественных ульев демонстрировали адаптированное и в целом более бедное патогенами бактериальное сообщество, за исключением P. larvae (более многочисленного, чем в сельском хозяйстве). Входы в сельскохозяйственные ульи, по сравнению с полуестественными, имели меньше положительных подкреплений против патогенов и загрязнений (т.е. меньшее количество Lactobacillus kunkeei и биоремедиаторов). В то время как естественные ульи набирали функции, распространенные среди сбалансированного метаболизма (например, синтез метионина), сельскохозяйственные ульи имели более активные пути, связанные со стрессом. Они рекрутировали грамотрицательные бактериальные пути для синтеза компонентов внешней мембраны (например, Kdo2-липида A, LPS), а также вызывающий жесткий ответ метаболизм ppGpp, который обеспечивает бактериальную персистенцию и патогенность (55,56). Полуприродные профили сместились в сторону естественного изобилия.

Внутренний воздух улья и пчелиный хлеб были наименее подверженными влиянию нишами в апибиоме. Ожидалось, что внутренний воздух, образованный плавающими абиотическими и биотическими частицами, находящимися в ульях, будет служить индикатором пригодности улья. Действительно, изменения в составе микробиома воздуха были связаны с загрязнением почвы, флоры и, возможно, окружающей среды (57) , а также с урбанизацией (58). Следовательно, мы ожидали различий между антропогенными и природными ландшафтами, но микробиота воздуха внутри улья оказалась в основном стабильной и практически не подверженной влиянию факторов окружающей среды. Это может быть связано с тем, что свободно плавающие частицы внутри ульев, как это происходит с гранулами пыльцы, могут прилипать к телу пчел и уменьшать количество доступных бактерий, которые можно отобрать из воздуха в улье. Антропизация оказала незначительное влияние на пчелиный хлеб, но различия между средами соответствовали изменениям, обнаруженным в кишечнике и на входе в улей. Состав образцов пчелиного хлеба напоминал предыдущие исследования (8,23,30), и в целом в естественных ульях наблюдалось незначительное обогащение кислото- и сахароустойчивыми бактериями, в то время как сельскохозяйственные ульи были обогащены Arsenophonus, ранее описанным в пчелином хлебе, полученном из различных мест обитания (23). Таким образом, Arsenophonus, скорее всего, передавался от сельскохозяйственных пчел к их кормовым запасам или наоборот, так как кишки сельскохозяйственных пчел были немного обогащены Arsenophonus. Заражение кормовых запасов потенциальными патогенами, такими как Arsenophonus, может негативно сказаться на здоровье медоносных пчел в сельскохозяйственной среде, поскольку потребление указанного корма может привести к дисбиозу микробиома кишечника или повлиять на весь апибиом.

Одним из основных результатов данного исследования стало промежуточное относительное обилие некоторых бактерий (например, Comensalibacter, Lactobacillus, Arsenophonus) и нескольких предсказанных путей (например, синтез UMP и пиримидина в кишках, синтез миколата и LPS у входа в улей), наблюдаемое в полуестественных ульях, что свидетельствует о существовании «промежуточного состояния» в полуестественной зоне. Промежуточное состояние было более распространенным для набора путей, чем для состава сообщества, что указывает на ранний функциональный ответ бактериального сообщества улья. Важно отметить, что 16 дней воздействия градиента антропогенеза было достаточно для изменения бактериальной фракции апибиома ульев. Сельскохозяйственные ульи оставались антропизированными, а полуестественные бактериальные апибиомы становились более сбалансированными, напоминая профили, найденные на неантропизированной пасеке. В качестве параллели, быстрая адаптация микробиома кишечника под давлением была отмечена у людей (59,60) и других млекопитающих (61). Аналогичным образом, анализ молекулярных биомаркеров в колониях медоносных пчел также продемонстрировал общее увеличение экспрессии вителлогенина (регуляторного белка пчел), антиоксидантных ферментов и иммунных белков в ульях, расположенных вблизи территорий, на которых проводится восстановление дикой природы в рамках Программы сохранения заповедников США (62). Наши результаты показывают, что размещение ульев на менее антропогенных территориях (более природных с меньшим сельскохозяйственным давлением) приведет к привлечению полезных бактерий (например, Lactobacillus и Commensalibacter в кишечнике медоносной пчелы) и вызовет функциональную реорганизацию. Действительно, восстановление среды обитания в сельскохозяйственных районах путем посадки местной флоры может способствовать восстановлению популяций опылителей3, включая диких пчел (63).

Заключение

Снижение антропотизации ульев увеличило относительную численность полезных бактерий во всех отобранных нишах апибиома, хотя и с разной скоростью, и вызвало сдвиги в прогнозируемых функциональных профилях кишок и входов в ульи. Эти результаты подчеркивают быструю адаптивность микробиомов, связанных с медоносными пчелами. Они предлагают простые стратегии управления для укрепления пчелиных колоний путем снижения воздействия антропогенеза (путем посадки местной флоры вокруг культур или переселения ульев в более естественные районы) при сохранении текущего сельскохозяйственного производства. Эти результаты также подчеркивают важность улья как единицы исследования для изучения микроорганизмов, а не пчел, чтобы понять вклад каждой ниши в здоровье и устойчивость колонии, а также важность их взаимодействия. Более масштабные продольные и долгосрочные анализы с учетом сезонных изменений позволят выявить глобальные закономерности антропотизации и основные микробы в нишах ульев, а также будут способствовать выявлению: (1) полезных профилей, которые могут быть направлены на укрепление здоровья медоносных пчел в любой период времени, (2) бактерий, ослабляющих колонии, и (3) биомаркеров, как Arsenophonus, обнаруженный в данной работе, указывающих на статус риска ульев в условиях антропотизации. Таким образом, контрольный список маркеров безопасности и опасности может быть разработан в качестве инструмента управления для использования в качестве биоиндикатора здоровья ульев.

Методы

Установка ульев и характеристика мест исследования

Образцы были получены с 3 пасек на территории Хорватии. 20 мая 2017 года в сельскохозяйственном регионе Мариянчаци (45.618139, 18.342667) было сформировано 33 улья с использованием 4 закрытых расплодных рамок с сопровождающими пчелами, 2 рамок с пыльцой/медом и спаренных маток. Ульи содержали по одному расплоду. Все рамки были стандартными Лангстрота, и во избежание генетической изменчивости использовались родственные матки и рабочие пчелы одного происхождения. Ульи перемещали на следующий день. Двадцать два улья были перемещены на расстояние 24 км в сельскохозяйственный район Козарац (45.717775, 18.680885), который в дальнейшем будет считаться антропогенной или сельскохозяйственной пасекой. Остальные 11 колоний были перемещены в Вардарац (45.621335, 18.775068), который примыкает к природному парку Копачки Рит и находится в 10 воздушных км от Козараца. Эти 11 колоний были определены как полуестественная пасека. Десять дополнительных ульев были расположены в Уние (44.637413, 14.250092), малонаселенном острове в Адриатическом море, далее именуемом естественной средой. Семь ульев уже были установлены на этом природном месте заранее. Все 7 ульев (1) не подвергались управлению с 2012 года (включая обработку пестицидами), (2) пережили заражение Varroa destructor и (3) были ранее изучены Муньосом-Колменеро и др. (30). Три дополнительных улья были получены из трех самых сильных естественных ульев (nnatural = 10). Ко всем 10 ульям, расположенным в этом природном ландшафте, были добавлены два супера. Все три пасеки оставались необработанными во время этого эксперимента.

Таким образом, пасеки подвергались градиенту антрофизации (сельскохозяйственные > полуестественные > естественные, от наиболее антропогенных к наименее) и были окружены различной флорой. Сельскохозяйственная эксплуатация и коммерческая практика пчеловодства являются регулярными в Осечко-Бараньске (охватывая пасеки Козарац и Вардарац). Пастбища, фруктовые деревья (яблони и сливы) и интенсивные коммерческие культуры, такие как рапс, пшеница, подсолнечник, кукуруза, соя и ячмень окружали сельскохозяйственную пасеку (30,64,65). Аналогичная местность окружала полуестественную пасеку, хотя с большим присутствием естественной флоры из-за близости (< 3 воздушных км) к зарослям осоки, тростника, кустарников и водно-болотных угодий, принадлежащих природному парку Копачки Рит (65). В противоположность этому, в природном месте Уние были пастбища, трава хохлатка, маки (оливковые рощи), хвойные леса и смешанные широколиственные деревья (дубы гольма) (66). Пахотные земли были ограничены небольшими лугами и кустарниковыми насаждениями вокруг деревни (65). Полуестественная среда прилегала (< 1 км) к особо охраняемой природной территории (ООПТ) и особо охраняемым природным территориям (ООПТ), а естественные ульи находились внутри ООПТ.

Измерение характеристик прочности колоний и нагрузки Varroa destructor

Параметры прочности колоний оценивались 6 июня 2017 года по методу Либефельда (67,69). Для взвешивания всех ульев использовались портативные электронные весы. Обе стороны всех рамок проверялись для измерения в полевых условиях площади взрослых пчел, расплода и пыльцы (дм2), а также стенки рамок и нижняя доска для измерения взрослых особей. Общая нагрузка взрослых пчел, расплода и пыльцы рассчитывалась путем умножения площади на 125 (взрослые пчелы) или 400 (расплод и пыльца), как требуется для стандартных рамок LR (Langstroth) (68). Нагрузка варроа измерялась одновременно методом сахарной пудры (69).

Статистический анализ различий в силе колоний между средами проводился в R (Rv3.6.6, 2020-02-29). Различия между средовыми значениями рассчитывали с помощью теста Тьюки (post-hoc) для факторов, удовлетворяющих предположениям ANOVA, и теста Крускала-Уоллиса и теста Данна (post hoc) (с использованием поправки Беньямина-Хохберга и пакета rstatix(70)) для ненормально распределенных факторов.

Сбор и обработка образцов для амплификации 16S рРНК

Образцы были собраны 6 июня 2017 года, через 17 дней после образования колоний. По мере возможности в каждом улье собирали 4 типа образцов: молодые рабочие пчелы, собранные с расплодных рамок (скорее всего, медсестры) для препарирования кишечника (G), 8 см2 пчелиного хлебного гребня, случайно выбранного из одной рамки (PB), микроорганизмы, прилипшие ко входу в улей и собранные тампоном, протирающим весь вход (S), и фильтры, содержащие отфильтрованный под вакуумом внутренний воздух (F) из улья. Старые рабочие особи не могли быть отобраны из-за короткого периода, прошедшего с момента образования улья. С входа брали мазок, протирая его слева и справа около 6 раз на кончик мазка (3-4 мазка на улей). Отбор проб воздуха проводили, помещая на верхнюю часть медового сусека пластиковый купол (купол Леклишко, изготовленный Дубравко Лесковичем) с перфорированной стороной, присоединенный к вакуумному пылесосу (Hf812, J.S.Holdings) с фильтрами. Вакуум оставляли работать в течение 10 мин. Пробы воздуха в полуестественной среде не отбирались из-за материальных ограничений. Стерилизация материала для отбора проб проводилась с использованием этанола 100% и ультрафиолетового света, а процедуры отбора проб проводились в соответствии с методикой Муньоса-Колменеро и др. (30). Образцы были заморожены в сухом льду до хранения при температуре — 20 °C в лаборатории генетики Университета Страны Басков (UPV/EHU). Всего было собрано 158 образцов из 43 ульев, участвовавших в данном исследовании.

Для каждого образца кишечника (N = 43) 10 кишок пчел были извлечены путем препарирования, объединены в 1,5 мл пробирку с 600 мкл 1xPBS, вихревым методом и центрифугированы при 8000 об/мин в течение 1 мин. Супернатант был собран и помещен в чистую пробирку объемом 1,5 мл. Этот процесс повторяли еще раз, добавляя 400 мкл 1xPBS для получения максимального объема жидкого образца. Супернатанты объединяли и хранили при — 20 °C. После этого отбирали 200 мкл надосадочной жидкости и использовали для выделения ДНК с помощью набора QIAamp® DNA Mini Kit (Qiagen), следуя протоколу производителя.

Что касается пчелиного хлеба (N = 41, не хватает 2 сельскохозяйственных образцов), 3-4 пыльцевые клетки были собраны случайным образом в каждом образце и помещены в пробирку объемом 2 мл. Лизис клеток и выделение ДНК проводили в соответствии с протоколом, установленным Муньос-Колменеро и др. (30).

В случае входа в улей (N = 42, отсутствовал 1 сельскохозяйственный образец), ватные части двух тампонов помещали в пробирку объемом 2 мл, добавляли 400 мкл 1xPBS, 20 мкл протеиназы K и 400 мкл буфера AL. Затем пробирки вихревым методом перемешивали и инкубировали при 56 °C и 900 об/мин в течение 90 мин. Полученный супернатант собирали и помещали в чистую пробирку объемом 2 мл. Этот этап был выполнен дважды, чтобы извлечь как можно больше микроорганизмов, после чего оба супернатанта объединили и добавили 400 мкл этанола. Смесь перемешивали вихрем, и 700 мкл из этой пробирки наносили на колонки QIAamp® DNA Mini Kit (Qiagen) для проведения экстракции ДНК, следуя протоколу производителя.

Экстракцию ДНК внутреннего воздуха (N = 32) проводили с использованием набора PowerSoil DNA Isolation Kit (PowerSoil). В пробирку PowerBead объемом 2 мл с 0,1 мм стеклянными бусинами (Qiagen) помещали половину фильтра и 60 мкл предварительно нагретого (до 60 °C) буфера для лизиса (0,1 М Трис-HCl, 0,05 М ЭДТА, 1,25% SDS, 0,002 мг/мл РНКазы) и предварительно нагретый раствор C1. Образцы гомогенизировали с помощью тканевого гомогенизатора Precellys 24 (Bertin Technologies) в течение 4 мин. Затем пробирки инкубировали при 65 °C в течение 15 мин и центрифугировали при 10 000×g в течение 30 с. Супернатант собирали и объединяли с 200 мкл раствора С2, после чего пробирки снова инкубировали при 4 °C в течение 5 мин и центрифугировали при 10 000×g в течение 1 мин. Примерно 700 мкл супернатанта затем переносили в пробирку для сбора 2 мл, куда добавляли 1200 мкл предварительно взболтанного раствора С4. Экстракцию проводили в соответствии с протоколом MO BIO Laboratories (MO BIO Laboratories).

Амплификация гена 16S рРНК

Характеристика бактериального сообщества проводилась путем амплификации области V4 гена 16S рРНК с использованием набора праймеров 515F/806R и протоколов, описанных в «Earth Microbiome Project» (http://www.earthmicrobiome.org/). Эти праймеры содержали адаптеры для секвенирования Illumina и последовательность штрих-кода длиной 12 п.н., связанную с прямыми праймерами, что позволяло идентифицировать образец. Амплификацию проводили с помощью протокола Illumina Amplicon Protocol, соблюдая ранее описанные условия и используя протокол «с блокирующими праймерами» для образцов пчелиного хлеба (30). Продукты ПЦР исследовали на 1,5% агарозном геле, окрашенном бромистым этидием. Очистка ДНК продуктов ПЦР, подготовка библиотек и парное секвенирование были проведены в Отделе секвенирования и генотипирования Университета Страны Басков (SGIKER). Секвенирование проводилось с использованием секвенатора Illumina MiSeq с набором v2 PE 2 × 150 bp (300 циклов), в качестве контроля для процесса секвенирования добавляли 10% PhiX.

Проверка качества и обработка последовательностей 16S

Качество необработанных последовательностей проверяли с помощью FastQC High Throughput Sequence QC Report v0.11.5 (71). Демультиплексирование последовательностей (без коррекции ошибок по Голею), углубленный контроль качества последовательностей методом деноизопары DADA2 (72) и таксономическое распределение проводили в программе Qiime2 v2.2 (Qiime2-2020.2) (73) в соответствии с рекомендуемыми пороговыми значениями. Варианты последовательности ампликонов (ASV), присутствующие в одном образце, были удалены. Исходная таблица признаков была разделена по типам образцов для создания наборов данных по типам образцов (наборы данных по кишечнику, пчелиному хлебу, входу в улей и внутреннему воздуху). Из этих наборов данных были сгенерированы филогенетические деревья с использованием выравнивания mafft и fasttree в Qiime2. Таксономический классификатор Наива Байеса был обучен с помощью q2-feature-classifier, используя наши спецификации данных о последовательности и эталонные последовательности гена 16S рРНК из базы данных SILVA 132, кластеризованные при 99% сходстве последовательностей (74). Таксономическому анализу предшествовало удаление митохондриальных и хлоропластных последовательностей. Относительная численность бактерий была представлена для филов и родов с помощью qiime taxa barplot. Классы бактерий, относительная численность которых составляла ≥ 0,1% во всех типах проб, были идентифицированы, а их относительные частоты визуализированы в процентах с помощью диаграмм «пончик» с использованием пакетов R ggplot2 и dplyr. Некоторые АСВ были классифицированы только до уровня домена и сгруппированы как «Бактерии», а для группировки остальных АСВ использовалась дополнительная группа «другие». Роды со средней относительной частотой ≥ 1,0% в каждой нише улья были представлены в виде гистограмм с помощью ggplot2, а роды со средней относительной частотой ≥ 0,1% в любой из сред для любой из ниш улья были представлены в виде таблиц.

Разнообразие и структура бактериального сообщества

Общая глубина секвенирования для всех типов образцов была определена с помощью кривых альфа-рефракции и использовалась для расчета и сравнения значений альфа-разнообразия между типами образцов. Таким образом, образцы с меньшей глубиной последовательности были отфильтрованы. Для каждой ниши улья филогенетическое разнообразие бактериального сообщества было определено в Qiime2 с помощью филогенетического разнообразия Фейта (PD) (75), а индекс равномерности Пиелоу (76) был использован для расчета равномерности сообщества. Разнообразие Шеннона использовалось для одновременного учета как разнообразия, так и равномерности. Значимые различия проверялись на основе парных тестов Крускала-Уоллиса и p-значений с поправкой на коэффициент ложного обнаружения Бенджамини и Хохберга (BH-FDR). Визуализация проводилась в R с помощью ggplot2 и dplyr. Затем глубина секвенирования для каждого типа образцов определялась с помощью кривых альфа-разрежения, и были получены наборы разреженных данных по каждому типу образцов для сравнения сред с помощью анализа альфа- и бета-разнообразия. Таким образом, образцы с меньшей глубиной последовательности были отфильтрованы. Для каждой ульевой ниши снова проводился анализ альфа-разнообразия, а для анализа бета-разнообразия рассчитывалось расстояние Брея-Кертиса (несходство состава сообщества) с помощью Qiime2 и визуализировалось как Principal Coordinate Analysis (PCoA) через редактор Vega (v5.22.1). Пермутационный многомерный дисперсионный анализ (PERMANOVA) был рассчитан в Qiime2 на основе разреженных матриц Брея-Кертиса и с парной коррекцией BH-FDR, чтобы определить, значительно ли различаются бактериальные сообщества между средами. Учитывая, что дисперсия данных может сбивать результаты PERMANOVA, однородность групповой дисперсии (PERMDISP) (77) для сред была рассчитана с помощью betadisper() на тех же матрицах. Основанные на корреляции Спирмена круговые деревья UPGMA (метод невзвешенных парных групп с арифметическим средним) были получены в Qiime2 и отображены с помощью iTOL (Interactive Tree of Life tool, v6.5.8) (78). Цвета, указывающие на уровень антропизации внутри деревьев UPGMA, были добавлены с помощью INKSCAPE (v0.92.3-1).

Идентификация таксонов, определяющих экологические различия

Таблицы частот признаков каждого типа образцов были свернуты на уровне рода и преобразованы в относительное обилие. Таблицы были загружены в веб-приложение Galaxy (79) , где для выявления бактерий, определяющих различия между средами, использовался линейный дискриминационный анализ (LDA) размерного эффекта (LEfSe) (80) . LEfSe использует непараметрический факториальный ранговый тест суммы Крускала-Уоллиса (81) для выявления дифференциально обильных таксонов, а затем канонический метод для расчета того, какие комбинации таксонов вносят больший вклад в различия между средами. Гистограммы и кладограммы результатов были построены в веб-приложении Galaxy, а названия таксонов в графиках очищены с помощью INKSCAPE v0.92.3-1. Таксоны считались значимыми, если непараметрический факториальный тест Крускала-Уоллиса имел p-значение ≤ 0,05 и логарифмические оценки LDA > 3,0. Возможные корреляции между бактериальными биомаркерами (таксоны с показателем LDA > 3,0 в LEfSe) в образцах из кишечника и входа в улей были изучены на уровне рода путем выполнения корреляционной матрицы Спирмена в R с помощью corr.test() из пакета Hmisc, применения коррекции BH-FDR и визуализации с помощью пакета corrplot. Нелинейное распределение выборки проверяли перед корреляционным анализом по Спирмену, используя тест нормальности shapiro.test в R (82) и коррекцию BH-FDR. Средняя относительная численность всех значимых родов была представлена в таблицах с использованием процентного соотношения.

Чтобы определить, могут ли изменения окружающей среды повлиять на функциональность апибиома медоносной пчелы, функциональное предсказание ферментов E.C. (83) и путей MetaCyc (84) было выполнено для образцов кишечника и входа в улей с использованием плагина PICRUSt2 v2.3.0-b (85) qiime2 q2-PICRUSt2 (v2019.10_0). Полученные таблицы Э.К. и путей были разрежены для анализа разнообразия. Функциональное разнообразие сред определяли с помощью индекса разнообразия Шеннона, а значимость рассчитывали с помощью парных тестов Крускала-Уоллиса. К p-значениям парного анализа применялась коррекция BH-FDR. Расстояния Брея-Кертиса визуализировались с помощью PCoA для определения различий между средами. Значимые различия предсказанных функций между средами определялись с помощью LEfSe и учитывались, если p-значение Крускала-Уоллиса ≤ 0,05 и LDA > 3,0. Среднее относительное количество значимых признаков рассчитывалось и визуализировалось в виде гистограмм с помощью пакетов ggplot2 и dplyr R.

Дополнительная информация

Дополнительная информация скачать

Ссылки

1.Kulhanek, K. et al. A national survey of managed honey bee 2015–2016 annual colony losses in the USA. J. Apic. Res. 56(4), 328–340. https://doi.org/10.1080/00218839.2017.1344496 (2017).
Article Google Scholar 

2.Potts, S. G. et al. Global pollinator declines: Trends, impacts and drivers. Trends Ecol. Evol. 25(6), 345–353. https://doi.org/10.1016/j.tree.2010.01.007 (2010).
Article Google Scholar 

3.Li, G. et al. The wisdom of honeybee defenses against environmental stresses. Front. Microbiol. 9, 722. https://doi.org/10.3389/fmicb.2018.00722 (2018).
Article Google Scholar 

4.Horak, R. D., Leonard, S. P. & Moran, N. A. Symbionts shape host innate immunity in honeybees. Proc. R. Soc. B. Biol. Sci. 287(1933), 20201184. https://doi.org/10.1098/rspb.2020.1184 (2020).
Article Google Scholar 

5.Dosch, C. et al. The gut microbiota can provide viral tolerance in the honey bee. Microorganisms. 9(4), 871. https://doi.org/10.3390/microorganisms9040871 (2021).
Article CAS Google Scholar 

6.Emery, O., Schmidt, K. & Engel, P. Immune system stimulation by the gut symbiont Frischella perrara in the honey bee (Apis mellifera). Mol. Ecol. 26(9), 2576–2590. https://doi.org/10.1111/mec.14058 (2017).
Article CAS Google Scholar 

7.Forsgren, E., Olofsson, T. C., Vásquez, A. & Fries, I. Novel lactic acid bacteria inhibiting Paenibacillus larvae in honey bee larvae. Apidologie 41(1), 99–108. https://doi.org/10.1051/apido/2009065 (2010).
Article Google Scholar 

8.Anderson, K. E., Sheehan, T. H., Eckholm, B. J., Mott, B. M. & DeGrandi-Hoffman, G. An emerging paradigm of colony health: Microbial balance of the honey bee and hive (Apis mellifera). Insectes Soc. 58(4), 431. https://doi.org/10.1007/s00040-011-0194-6 (2011).
Article Google Scholar 

9.Zheng, H., Powell, J. E., Steele, M. I., Dietrich, C. & Moran, N. A. Honeybee gut microbiota promotes host weight gain via bacterial metabolism and hormonal signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. 114(18), 4775–4780. https://doi.org/10.1073/pnas.1701819114 (2017).
Article ADS CAS Google Scholar 

10.Kešnerová, L. et al. Disentangling metabolic functions of bacteria in the honey bee gut. PLoS Biol. 15(12), e2003467. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2003467 (2017).
Article CAS Google Scholar 

11.Bonilla-Rosso, G. & Engel, P. Functional roles and metabolic niches in the honey bee gut microbiota. Curr. Opin. Microbiol. 43, 69–76. https://doi.org/10.1016/j.mib.2017.12.009 (2018).
Article CAS Google Scholar 

12.Ellegaard, K. M. et al. Extensive intra-phylotype diversity in lactobacilli and bifidobacteria from the honeybee gut. BMC Genomics 16(1), 284. https://doi.org/10.1186/s12864-015-1476-6 (2015).
Article CAS Google Scholar 

13.Kwong, W. K. & Moran, N. A. Gut microbial communities of social bees. Nat. Rev. Microbiol. 14(6), 374–384. https://doi.org/10.1038/nrmicro.2016.43 (2016).
Article CAS Google Scholar 

14.Jones, J. C. et al. Gut microbiota composition is associated with environmental landscape in honey bees. Ecol. Evol. 8(1), 441–451. https://doi.org/10.1002/ece3.3597 (2017).
Article Google Scholar 

15.D’Alvise, P. et al. The impact of winter feed type on intestinal microbiota and parasites in honey bees. Apidologie 49(2), 252–264. https://doi.org/10.1007/s13592-017-0551-1 (2018).
Article CAS Google Scholar 

16.Castelli, L. et al. Impact of nutritional stress on honeybee gut microbiota, immunity, and Nosema ceranae infection. Microb. Ecol. 80(4), 908–919. https://doi.org/10.1007/s00248-020-01538-1 (2020).
Article CAS Google Scholar 

17.Campbell, J. B. et al. The fungicide Pristine^® inhibits mitochondrial function in vitro but not flight metabolic rates in honey bees. J. Insect. Physiol. 86, 11–16. https://doi.org/10.1016/j.jinsphys.2015.12.003 (2016).
Article CAS Google Scholar 

18.Kakumanu, M. L., Reeves, A. M., Anderson, T. D., Rodrigues, R. R. & Williams, M. A. Honey bee gut microbiome is altered by in-hive pesticide exposures. Front. Microbiol. https://doi.org/10.3389/fmicb.2016.01255 (2016).
Article Google Scholar 

19.Abbo, P. M. et al. Effects of Imidacloprid and Varroa destructor on survival and health of European honey bees, Apis mellifera. Insect Sci. 24(3), 467–477. https://doi.org/10.1111/1744-7917.12335 (2017).
Article CAS Google Scholar 

20.DeGrandi-Hoffman, G., Corby-Harris, V., DeJong, E. W., Chambers, M. & Hidalgo, G. Honey bee gut microbial communities are robust to the fungicide Pristine^® consumed in pollen. Apidologie 48(3), 340–352. https://doi.org/10.1007/s13592-016-0478-y (2017).
Article CAS Google Scholar 

21.Motta, E. V. S., Powell, J. E., Leonard, S. P. & Moran, N. A. Prospects for probiotics in social bees. Philos. Trans. R. Soc. B. 377, 20210156. https://doi.org/10.1098/rstb.2021.0156 (2022).
Article CAS Google Scholar 

22.Corby-Harris, V., Maes, P. & Anderson, K. E. The bacterial communities associated with honey bee (Apis mellifera) foragers. PLoS ONE 9(4), e95056. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0095056 (2014).
Article ADS CAS Google Scholar 

23.Donkersley, P., Rhodes, G., Pickup, R. W., Jones, K. C. & Wilson, K. Bacterial communities associated with honeybee food stores are correlated with land use. Ecol. Evol. 8(10), 4743–4756. https://doi.org/10.1002/ece3.3999 (2018).
Article Google Scholar 

24.Mullin, C. A. et al. High levels of miticides and agrochemicals in North American apiaries: Implications for honey bee health. PLoS ONE 5(3), e9754. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0009754 (2010).
Article ADS CAS Google Scholar 

25.Miller, D. L., Parish, A. J. & Newton, I. L. Transitions and transmission: Behavior and physiology as drivers of honey bee-associated microbial communities. Curr. Opin. Microbiol. 50, 1–7. https://doi.org/10.1016/j.mib.2019.08.001 (2019).
Article Google Scholar 

26.Drew, G. C. et al. Transitions in symbiosis: Evidence for environmental acquisition and social transmission within a clade of heritable symbionts. ISME J. 15, 2956–2968. https://doi.org/10.1038/s41396-021-00977-z (2021).
Article Google Scholar 

27.Forfert, N. et al. Parasites and pathogens of the honeybee (Apis mellifera) and their influence on inter-colonial transmission. PLoS ONE 10(10), e0140337. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0140337 (2015).
Article CAS Google Scholar 

28.Erban, T. et al. Bacterial community associated with worker honeybees (Apis mellifera) affected by European foulbrood. PeerJ 5, e3816. https://doi.org/10.7717/peerj.3816 (2017).
Article CAS Google Scholar 

29.Anderson, K. E. et al. Microbial ecology of the hive and pollination landscape: Bacterial associates from floral nectar, the alimentary tract and stored food of honey bees (Apis mellifera). PLoS ONE 8(12), e83125. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0083125 (2013).
Article ADS CAS Google Scholar 

30.Muñoz-Colmenero, M. et al. Differences in honey bee bacterial diversity and composition in agricultural and pristine environments—A field study. Apidologie 51(6), 1018–1037. https://doi.org/10.1007/s13592-020-00779-w (2020).
Article Google Scholar 

31.Locke, B. & Fries, I. Characteristics of honey bee colonies (Apis mellifera) in Sweden surviving Varroa destructor infestation. Apidologie 42, 53342. https://doi.org/10.1007/s13592-011-0029-5 (2011).
Article Google Scholar 

32.Kešnerová, L. et al. Gut microbiota structure differs between honeybees in winter and summer. ISME J. 14(3), 801–814. https://doi.org/10.1038/s41396-019-0568-8 (2020).
Article Google Scholar 

33.Raymann, K., Shaffer, Z. & Moran, N. A. Antibiotic exposure perturbs the gut microbiota and elevates mortality in honeybees. PLoS Biol. 15(3), e2001861. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2001861 (2017).
Article CAS Google Scholar 

34.Martinson, V. G., Moy, J. & Moran, N. A. Establishment of characteristic gut bacteria during development of the honeybee worker. Appl. Environ. Microbiol. 78(8), 2830–2840. https://doi.org/10.1128/AEM.07810-11 (2012).
Article ADS CAS Google Scholar 

35.Kwong, W. K., Mancenido, A. L. & Moran, N. A. Immune system stimulation by the native gut microbiota of honey bees. R. Soc. Open. Sci. 4(2), 170003. https://doi.org/10.1098/rsos.170003 (2017).
Article ADS CAS Google Scholar 

36.Koch, H. & Schmid-Hempel, P. Socially transmitted gut microbiota protect bumble bees against an intestinal parasite. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108(48), 19288–19292. https://doi.org/10.1073/pnas.1110474108 (2011).
Article ADS Google Scholar 

37.Budge, G. E. et al. Identifying bacterial predictors of honey bee health. J. Invertebr. Pathol. 141, 41–44. https://doi.org/10.1016/j.jip.2016.11.003 (2016).
Article Google Scholar 

38.Cornman, R. S. et al. Pathogen webs in collapsing honey bee colonies. PLoS ONE 7(8), e43562. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0043562 (2012).
Article ADS CAS Google Scholar 

39.Kwong, W. K., Engel, P., Koch, H. & Moran, N. A. Genomics and host specialization of honey bee and bumble bee gut symbionts. Proc. Natl. Acad. Sci. 111(31), 11509–11514. https://doi.org/10.1073/pnas.1405838111 (2014).
Article ADS CAS Google Scholar 

40.Raza, M. F. et al. Gut microbiota promotes host resistance to low-temperature stress by stimulating its arginine and proline metabolism pathway in adult Bactrocera dorsalis. PLoS Pathog. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008441 (2020).
Article Google Scholar 

41.Kaivosaari, S., Finel, M. & Koskinen, M. N-glucuronidation of drugs and other xenobiotics by human and animal UDP-glucuronosyltransferases. Xenobiotica 41(8), 652–669. https://doi.org/10.3109/00498254.2011.563327 (2011).
Article CAS Google Scholar 

42.Wang, M., Chen, S., Chen, L. & Wang, D. Responses of soil microbial communities and their network interactions to saline-alkaline stress in Cd-contaminated soils. Environ. Pollut. 252, 1609–1621. https://doi.org/10.1016/j.envpol.2019.06.082 (2019).
Article CAS Google Scholar 

43.Asaf, S., Numan, M., Khan, A. L. & Al-Harrasi, A. Sphingomonas: From diversity and genomics to functional role in environmental remediation and plant growth. Crit. Rev. Biotechnol. 40(2), 138–152. https://doi.org/10.1080/07388551.2019.1709793 (2020).
Article CAS Google Scholar 

44.Zhang, C. et al. Response of soil microbes after direct contact with pyraclostrobin in fluvo-aquic soil. Environ. Pollut. 255, 113164. https://doi.org/10.1016/j.envpol.2019.113164 (2019).
Article CAS Google Scholar 

45.Li, F., Chen, L., Zhang, J., Yin, J. & Huang, S. Bacterial community structure after long-term organic and inorganic fertilization reveals important associations between soil nutrients and specific taxa involved in nutrient transformations. Front. Microbiol. 8, 187. https://doi.org/10.3389/fmicb.2017.00187 (2017).
Article Google Scholar 

46.Gatheru, W. M., Sun, K. & Gao, Y. Sphingomonads in microbe-assisted phytoremediation: Tackling soil pollution. Trends Biotechnol. 35(9), 883–899. https://doi.org/10.1016/j.tibtech.2017.06.014 (2017).
Article CAS Google Scholar 

47.Qin, C. et al. Responses of phyllosphere microbiota and plant health to application of two different biocontrol agents. AMB Express 9(1), 42. https://doi.org/10.1186/s13568-019-0765-x (2019).
Article Google Scholar 

48.Zhou, L. et al. Abundance and diversity of Sphingomonas in Shenfu petroleum-wastewater irrigation zone, China. Environ. Sci. Pollut. Res. 19(1), 282–294. https://doi.org/10.1007/s11356-011-0552-y (2012).
Article CAS Google Scholar 

49.Velić, J., Kišić, K. & Krasić, D. The characteristics of the production and processing of oil and natural gas in Croatia from 2000 to 2014. RGN zbornik. 31(2), 69–112. https://doi.org/10.17794/rgn.2016.2.6 (2016).
Article CAS Google Scholar 

50.De Smet, J., Hendrix, H., Blasdel, B. G., Danis-Wlodarczyk, K. & Lavigne, R. Pseudomonas predators: Understanding and exploiting phage–host interactions. Nat. Rev. Microbiol. 15(9), 517–530.  https://doi.org/10.1038/nrmicro.2017.61  (2017).
Article CAS Google Scholar 

51.Haenni, M., Lupo, A. & Madec, J.-Y. Antimicrobial resistance in Streptococcus spp. Microbiol. Spectr. https://doi.org/10.1128/microbiolspec.ARBA-0008-2017 (2018).
Article Google Scholar 

52.Murphy, E. C. & Frick, I.-M. Gram-positive anaerobic cocci–commensals and opportunistic pathogens. FEMS Microbiol. Rev. 37(4), 520–553. https://doi.org/10.1111/1574-6976.12005 (2013).
Article CAS Google Scholar 

53.Genersch, E. American Foulbrood in honeybees and its causative agent, Paenibacillus larvae. J. Invertebr. Pathol. 103(Suppl 1), S10-19. https://doi.org/10.1016/j.jip.2009.06.015 (2010).
Article Google Scholar 

54.Arredondo, D. et al. Lactobacillus kunkeei strains decreased the infection by honey bee pathogens Paenibacillus larvae and Nosema ceranae. Benef. Microbes. 9(2), 279–290. https://doi.org/10.3920/BM2017.0075 (2018).
Article CAS Google Scholar 

55.Dalebroux, Z. D., Svensson, S. L., Gaynor, E. C. & Swanson, M. S. ppGpp conjures bacterial virulence. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 74(2), 171–199. https://doi.org/10.1128/MMBR.00046-09 (2010).
Article CAS Google Scholar 

56.Pacios, O. et al. (p)ppGpp and its role in bacterial persistence: New challenges. Antimicrob. Agents. Chemother. https://doi.org/10.1128/AAC.01283-20 (2020).
Article Google Scholar 

57.Cao, C. et al. Inhalable microorganisms in Beijing’s PM2.5 and PM10 pollutants during a severe smog event. Environ. Sci. Technol. 48(3), 1499–1507. https://doi.org/10.1021/es4048472 (2014).
Article ADS CAS Google Scholar 

58.Barberán, A. et al. Continental-scale distributions of dust-associated bacteria and fungi. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 112(18), 5756–5761. https://doi.org/10.1073/pnas.1420815112 (2015).
Article ADS CAS Google Scholar 

59.David, L. A. et al. Diet rapidly and reproducibly alters the human gut microbiome. Nature 505(7484), 559–563. https://doi.org/10.1038/nature12820 (2014).
Article ADS CAS Google Scholar 

60.Uhr, G. T., Dohnalová, L. & Thaiss, C. A. The dimension of time in host-microbiome interactions. mSystems. https://doi.org/10.1128/mSystems.00216-18 (2019).
Article Google Scholar 

61.Seddik, H., Xu, L., Wang, Y. & Mao, S. Y. A rapid shift to high-grain diet results in dynamic changes in rumen epimural microbiome in sheep. Animal https://doi.org/10.1017/S1751731118003269 (2018).
Article Google Scholar 

62.Ricigliano, V. A. et al. Honey bee colony performance and health are enhanced by apiary proximity to US Conservation Reserve Program (CRP) lands. Sci Rep. 9, 4894. https://doi.org/10.1038/s41598-019-41281-3 (2019).
Article ADS CAS Google Scholar 

63.Tonietto, R. K. & Larkin, D. J. Habitat restoration benefits wild bees: A meta-analysis. J. Appl. Ecol. 55(2), 582–590. https://doi.org/10.1111/1365-2664.13012 (2018).
Article Google Scholar 

64.Glavaš, H., Ivanović, M. & Mandic, N. Resources and possibilities of agro biomass usage for energy purposes in Slavonia region (Croatia). In IEEE International Energy Conference (ENERGYCON), 1150–1155. https://doi.org/10.1109/ENERGYCON.2014.6850568 (2014).

65.European Environment Agency–Ecosystem types of Europe. Data available at: https://www.eea.europa.eu/data-and-maps/data/ecosystem-types-of-europe-1. (2019) (Accessed 8 April 2021).

66.Starc, N. Small islands and Large Scale Spatial Development Patterns-story of the Croatian island of Unije. European Regional Science Association, ERSA conference papers. https://www.researchgate.net/publication/23731990_Small_Islands_and_Large_Scale_Spatial_Development_Patterns_-_Story_of_the_Croatian_Island_of_Unije. (2006) (Accessed 4 April 2021).

67.Delaplane, K. S., van der Steen, J. & Guzman-Novoa, E. Standard methods for estimating strength parameters of Apis mellifera colonies. J. Apic. Res. 52(1), 1–12. https://doi.org/10.3896/IBRA.1.52.1.03 (2013).
Article Google Scholar 

68.Imdorf, A., Buehlmann, G., Gerig, L., Kilchenmann, V. & Wille, H. Überprüfung der Schätzmethode zur Ermittlung der Brutfläche und der Anzahl Arbeiterinnen in freifliegenden Bienenvölkern. Apidologie 18(2), 137–146. https://doi.org/10.1051/apido:19870204 (1987).
Article Google Scholar 

69.Dietemann, V. et al. Standard methods for varroa research. J. Apic. Res. 52(1), 1–54. https://doi.org/10.3896/IBRA.1.52.1.09 (2013).
Article Google Scholar 

70.Kassambara, A. rstatix: Pipe-Friendly Framework for Basic Statistical Tests. R package version 0.7.0. https://CRAN.R-project.org/package=rstatix (2021).

71.Andrews, S. FastQC: A Quality Control tool for high throughput sequence data. https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2010).

72.Callahan, B. J. et al. DADA2: High resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nat. Methods. 13(7), 581–583. https://doi.org/10.1038/nmeth.3869 (2016).
Article CAS Google Scholar 

73.Bolyen, E. et al. Reproducible, interactive, scalable and extensible microbiome data science using QIIME 2. Nat. Biotechnol. 37(8), 852–857. https://doi.org/10.1038/s41587-019-0209-9 (2019).
Article CAS Google Scholar 

74.Quast, C. et al. The SILVA ribosomal RNA gene database project: Improved data processing and web-based tools. Nucleic. Acids. Res. 41(D1), D590–D596. https://doi.org/10.1093/nar/gks1219 (2013).
Article MathSciNet CAS Google Scholar 

75.Faith, D. P. Conservation evaluation and phylogenetic diversity. Biol. Conserv. 61(1), 1–10. https://doi.org/10.1016/0006-3207(92)91201-3 (1992).
Article Google Scholar 

76.Pielou, E. C. The measurement of diversity in different types of biological collections. J. Theor. Biol. 13, 131–144. https://doi.org/10.1016/0022-5193(66)90013-0 (1966).
Article ADS Google Scholar 

77.Anderson, M. J. Distance-based tests for homogeneity of multivariate dispersions. Biometrics 62, 245–253. https://doi.org/10.1111/j.1541-0420.2005.00440.x (2006).
Article MathSciNet MATH Google Scholar 

78.Letunic, I. & Bork, P. Interactive Tree Of Life (iTOL) v5: An online tool for phylogenetic tree display and annotation. Nucleic. Acids. Res. 49(W1), W293–W296. https://doi.org/10.1093/nar/gkab301 (2021).
Article CAS Google Scholar 

79.Afgan, E. et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2018 update. Nucleic. Acids. Res. 46(Web Server issue), W537–W544. https://doi.org/10.1093/nar/gky379 (2018).
Article CAS Google Scholar 

80.Segata, N. et al. Metagenomic biomarker discovery and explanation. Genome Biol. 12(6), R60. https://doi.org/10.1186/gb-2011-12-6-r60 (2011).
Article Google Scholar 

81.Kruskal, W. H. & Wallis, W. A. Use of ranks in one-criterion variance analysis. J. Am. Stat. Assoc. 47, 583–621. https://doi.org/10.1080/01621459.1952.10483441 (1952).
Article MATH Google Scholar 

82.Royston, J. P. An extension of Shapiro and Wilk’s W test for normality to large samples. J. R. Stat. Soc. Ser. C. Appl. Stat. 31(2), 115–124. https://doi.org/10.2307/2347973 (1982).
Article MATH Google Scholar 

83.Bairoch, A. The ENZYME database in 2000. Nucleic. Acids. Res. 28(1), 304–305. https://doi.org/10.1093/nar/28.1.304 (2000).
Article CAS Google Scholar 

84.Caspi, R. et al. The MetaCyc database of metabolic pathways and enzymes—A 2019 update. Nucleic. Acids. Res. 48(D1), D445–D453. https://doi.org/10.1093/nar/gkz862 (2020).
Article CAS Google Scholar 

85.Douglas, G. M. et al. PICRUSt2 for prediction of metagenome functions. Nat. Biotechnol. 38(6), 685–688. https://doi.org/10.1038/s41587-020-0548-6 (2020).
Article CAS Google Scholar