Мед как функциональное питание для Apis mellifera

Аннотация

Хотя нектар потребляется, главным образом в качестве дополнительного корма, широким кругом насекомых, охватывающим по меньшей мере пять порядков, его переработкой и хранением занимается лишь небольшое число видов, большинство из которых — пчелы и осы из надсемейства Apoidea. В этой группе Apis mellifera выработал замечательные адаптации, облегчающие переработку и хранение нектара; при этом этот вид использует конечный продукт — мед — для выполнения различных функций, аналогов которым практически нет у других насекомых-фитофагов. Мед и его фитохимические компоненты, некоторые из которых, вероятно, происходят из прополиса, имеют функциональное значение в защите медоносных пчел от микробных патогенов, токсинов и холодового стресса, а также в регулировании развития и продолжительности жизни взрослых особей. Отличительные свойства меда A. mellifera возникли многими путями, включая модификацию генома, партнерство с микробными симбионтами и эволюцию специализированного поведения, включая добычу других веществ, помимо нектара. Тот факт, что при производстве меда у A. mellifera используются не только нектар, но и эндогенные продукты, такие как антимикробные пептиды и маточное молочко, говорит о том, что рассматривать мед как источник углеводов для пчел — это концепция, нуждающаяся в пересмотре.

ВВЕДЕНИЕ

Среди 200 000 видов животных, выполняющих роль опылителей (101), лишь небольшая часть питается исключительно цветочными ресурсами на протяжении всего жизненного цикла из-за экологических и физиологических проблем, связанных с потреблением этой пищи. Специализация на потреблении цветочной пищи, особенно нектара, достигла вершины у Apis mellifera, западной медоносной пчелы, достигнув набора необычных адаптаций, включающих как переработку, так и хранение пищи. Биологически активные компоненты меда, помимо сахаров, вносят существенный вклад в здоровье пчел в различных контекстах, которые, в силу уникальной природы многолетней эусоциальности и связанной с ней переработки и хранения пищи, не имеют аналогов у обычных травоядных или даже у других флоровидных (питающихся цветами) перепончатокрылых. Однако вопрос о том, как эволюционировал этот набор адаптаций, остается открытым.

ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ И ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОБЛЕМЫ НЕКТАРОЯДЕНИЯ

Нектар — это ткань растения, у которой нет никакой известной функции, кроме вознаграждения мутуалистов; поэтому в литературе он долгое время считался химически безвредным, привлекательным для самого широкого круга потребителей среди цветочных вознаграждений (60). Не обладая значительным количеством белка, цветочный нектар не может служить полноценным источником питания для мутуалистов, и не существует известных животных, питающихся нектаром, которые в течение своего жизненного цикла не потребляли бы и другие богатые белком или липидами материалы. Пыльца часто является основным источником белка для нектароядных, но альтернативными источниками белка являются ткани растений, грибы, другие членистоногие (особенно на личиночных стадиях) и кровь позвоночных на взрослых стадиях.

Помимо питания, основной проблемой для организмов, зависящих от нектара, является то, что как источник пищи он непредсказуем — временной эфемерен, пространственно изменчив и фитохимически идиосинкразичен (1, 108). Фитохимические вещества опосредуют взаимодействие растений с другими организмами; что касается нектара и пыльцы, фитохимические вещества влияют на взаимодействие как с мутуалистами (например, опылителями), так и с антагонистами (например, похитителями нектара). В сравнительном анализе фитохимических веществ нектара и пыльцы Палмер-Янг и др. (115) обнаружили, что оба типа тканей часто содержат флавоноиды (с преобладанием гликозидов кверцетина и каемпферола), фенольные вещества (особенно фенилпропаноиды), терпеноиды и алкалоиды. Химический состав нектара и пыльцы различается как качественно, так и количественно: в пыльце содержание химических веществ на 63% выше, чем в нектаре, а в пыльце — от 24-кратного до 235-кратного. Химический состав нектара демонстрировал большую изменчивость в пределах участка и сорта, чем химический состав пыльцы.

Будучи легкоусвояемым источником углеводной энергии, нектар уязвим для кражи неуместными цветочными посетителями, которые потребляют нектар, не оказывая услуг по опылению, или микробами, которые упреждают его использование опылителями, ухудшая его качество. Медоносные пчелы, например, избегают нектара, содержащего определенные бактериальные сообщества (61, 74). Многие фитохимические вещества нектара, особенно фенольные и алкалоиды, являются антимикробными (1, 108) и могут защищать от микробного изменения качества. Кроме того, алкалоиды, фенольные и другие фитохимические вещества могут защищать нектар от нежелательных посетителей-животных, действуя как сдерживающие факторы (143). Помимо отпугивания нектарных воров или грабителей, ограничение размера пищи даже эффективных опылителей может в некоторых случаях принести пользу растению, побуждая их покинуть растение и возобновить кормежку на других цветках-конспецификах, увеличивая возможности перекрестного оплодотворения (105).

РЕШЕНИЯ МЕДОНОСНОЙ ПЧЕЛЫ ДЛЯ ПОТРЕБЛЕНИЯ НЕКТАРА

Создание меда A. mellifera в качестве формы хранения нектара позволяет обойти или свести к минимуму проблемы непредсказуемости, эфемерности, подверженности микробному загрязнению и фитохимической изменчивости. В процессе эволюции возникло несколько характерных форм поведения, некоторые из которых могут быть уникальными для видов Apis, которые облегчают превращение нектара (и других богатых углеводами продуктов) в мед. Будучи эусоциальным видом, A. mellifera использует рабочую силу из высокомобильных взрослых особей для сбора нектара по мере его поступления в ландшафт, используя сложную коммуникацию для информирования сородичей о местонахождении и качестве источников нектара (35). Обычно особи начинают добывать корм через две-три недели после всходов, в основном пыльцу и нектар. Нектар, обычно представляющий собой разбавленный раствор сахаров, является основным сырьевым ингредиентом меда, хотя собираются и используются и другие богатые углеводами продукты, включая медовую росу гомоптеринов и, в последнее время, конфеты, газировку и другие продукты питания человека (121). Возвращающиеся фуражиры переносят нектар с поля в свой урожай (медовый желудок), в это время начинается ферментативная переработка (107, 147), и, возвращаясь в улей, они выбрасывают содержимое ожидающим сородичам. Группа гнездовых рабочих (пчелы, принимающие нектар или хранящие пищу) продолжает переработку нектара, способствуя удалению воды: каждая особь всасывает и срыгивает нектар на свой хоботок, тем самым увеличивая площадь его поверхности и ускоряя испарение. Другие рабочие еще больше способствуют испарению, размахивая крыльями для усиления циркуляции внутри улья (35).

Активное испарение снижает содержание воды в нектаре примерно с 80-90% до 50-60%; затем этот более концентрированный раствор помещается в ячейки и периодически перемещается, пассивно обезвоживаясь до достижения конечной концентрации 18-25%, после чего ячейка укупоривается. Высокая концентрация сахара делает зрелый мед гигроскопичным, а в виде перенасыщенного раствора сахара он неблагоприятен для роста микроорганизмов (39). Среди видов Apis средняя влажность меда у A. mellifera несколько ниже, чем у ее сородичей. Аналогично, мед безжалостных пчел (Meliponini) обычно имеет более высокое содержание влаги, чем мед, произведенный симпатрическими видами A. mellifera (Таблица 1).

Таблица 1: Содержание воды в меде видов Apis и meliponine

Помимо поведения, в биохимической переработке нектара в мед участвует особый набор ферментов. По мере концентрации нектара пчелы добавляют ферменты для метаболизма компонентов нектара. Активность сукразы — расщепление дисахарида сахарозы на составляющие его моносахариды глюкозу и фруктозу — позволяет пчелам получить перенасыщенный раствор, увеличивая количество растворителей в объеме жидкости. Это, в свою очередь, повышает осмолярность меда и его микробную токсичность; микробы, которые не являются осмотолерантными, могут погибнуть в результате плазмолиза и экзосмоса. Также в переработке нектара в мед участвует глюкозооксидаза (GOX), которая, окисляя глюкозу с образованием глюконовой кислоты и перекиси водорода, защищает мед от микробной деградации, понижая pH и стерилизуя среду путем образования свободных гидроксильных радикалов и последующего окисления бактериальной ДНК, мембранных липидов и белков (85).

Поскольку нектары, а значит и мед, могут содержать значительное количество потенциально токсичных фитохимических веществ, опосредованная ферментами детоксикация фитохимических веществ является необходимым условием для использования продуктов питания на основе нектара. У A. mellifera основными ферментами первой фазы детоксикации ксенобиотиков являются монооксигеназы цитохрома P450 (P450) (11). Однако некоторая детоксикация может происходить пассивно. По мере созревания меда в улье он подвергается воздействию температуры в улье, поддерживаемой в диапазоне 35°C; содержание фенолов в нектаре Aloe littoralis значительно снижается с 0,65% до 0,49% после воздействия этих температур в улье Apis cerana в течение 24 часов (86), что позволяет предположить, что виды Apis могут обладать определенной способностью готовить мед, чтобы сделать его менее химически опасным.

Вода и растительные смолы также участвуют в производстве и использовании меда. Некоторая часть фуражиров собирает воду и временно хранит ее для различных целей, включая не только испарительное охлаждение (113), но и разбавление меда; из-за высокой вязкости мед обычно должен быть разбавлен пчелами-кормилицами для кормления личинок и взрослых особей, особенно зимой. Что касается смол, то некоторые кормилицы собирают их для переработки в прополис — антимикробную смесь, которая в диких колониях покрывает практически все внутренние поверхности гнезда (образуя прополисную оболочку) (141). Хотя источники растительной смолы широко варьируются, медоносные пчелы проявляют явные предпочтения к определенным видам растений (и даже хемотипам внутри вида) (44). Прополис долгое время считался структурным агентом, обеспечивающим прочность клеточных стенок, а также противомикробным средством (125), но химическая избирательность сборщиков смолы предполагает, что пчелы различают источники смолы по их биологической активности (44).

Среди основных фитохимических веществ, обнаруженных в меде в северных широтах — пинобанксин, пиноцембрин, кверцетин, хризин и галангин (72) — лишь немногие встречаются в цветочных нектарах, но все они широко распространены в прополисе. Смолы, похоже, не потребляются напрямую [Simone-Finstrom et al. (138, p. 8) утверждают: «Насколько нам известно, медоносные пчелы не потребляют прополис в естественных условиях… способ действия терапевтического эффекта прополиса на патогены колонии, вероятно, через летучие соединения… или прямой контакт»], но фитохимические вещества смолы могут быть доступны для потребления благодаря способности меда, особенно на ранних стадиях созревания в ячейках, пока он еще разбавлен, поглощать их. Водные экстракты прополиса обычно содержат много фенольных кислот, включая производные коричной кислоты (159), которые широко встречаются в меде.

Обработка пищи перед хранением с целью продления срока годности является исключительно необычным явлением среди животных. Человек, возможно, уникален тем, что участвует в различных видах переработки пищи, которые повышают ее пригодность и консистенцию для потребления, обеспечивают ее доступность в периоды дефицита, удаляют токсины, облегчают транспортировку и распределение, а также деактивируют портящиеся микробы (67). Все эти функции в той или иной степени имеют параллели в жизни пчел, делающих мед. Хотя мед имеет огромное пищевое значение как основной источник энергии для полета, терморегуляции и производства воска, его фитохимические вещества с их разнообразными биологическими свойствами, включая антимикробную активность, но не ограничиваясь ею, делают его вполне пригодным для использования в качестве функциональной пищи.

МЕД КАК ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ПИЩА

То, что производство меда A. mellifera включает в себя множество других материалов, помимо нектара из окружающей среды и внутренних источников, не согласуется с давним убеждением, что мед служит для пчел не более чем источником углеводов (10, 136). Как заметили Эрлер и Мориц (47, с. 391), «именно способность запасать огромное разнообразие кормовых антимикробных веществ дает колонии медоносных пчел огромное преимущество не только среди пчел-опылителей, но и перед многими другими социальными насекомыми, требующими в своем рационе животного белка. Способность запасать пищу дает медоносным пчелам возможность избирательного выбора среди разнообразия запасаемых продуктов в адаптивной зависимости от состояния здоровья их самих или колонии.» Медоносные пчелы, однако, делают больше, чем просто хранят пищу — пчелы тщательно перерабатывают нектар и пыльцу, прежде чем запастись ими.

Функциональные продукты питания определяются как продукты, которые «содержат основные питательные вещества, часто превышающие количество, необходимое для нормального поддержания, роста и развития, и/или другие биологически активные компоненты, приносящие пользу здоровью или желательные физиологические эффекты» (148, с. 52). Эта концепция, введенная в литературу по питанию человека более 30 лет назад, редко применяется к нечеловеческим видам, но, учитывая «исключительную способность колонии медоносной пчелы хранить кормовые растительные продукты в течение длительных периодов времени» (47, стр. 391), он обеспечивает теоретическую основу для понимания влияния меда на здоровье пчел, которое нелегко объяснить его питательностью, подобно тому, как термины самолечение, фармакофагия и фармакофория по-разному использовались для описания лекарственного использования непищевого растительного материала в ответ на паразитарную инфекцию или другие заболевания (47, 52). Как функциональный продукт питания, мед отличается от растительного сырья, потребляемого только в ответ на специфические стрессы, тем, что он является обычным продуктом питания, способствующим укреплению здоровья благодаря содержанию нутрицевтиков — термин, введенный в 1989 году для описания «продуктов питания или их частей, которые обеспечивают медицинские или оздоровительные преимущества, включая профилактику и лечение заболеваний» (22). Нутрицевтики рассматриваются как «набор инструментов для профилактики заболеваний» (37, стр. 876) или как «[пищевые] продукты, которые следует принимать как часть обычной диеты, чтобы получить полезные эффекты, выходящие за рамки основных питательных функций» (29, стр. 4).

Как ни странно, Сато и Мията (134) признали мед функциональным продуктом питания и источником нутрицевтиков для человека задолго до того, как возникли подозрения о его многогранной роли в здоровье медоносных пчел. Многие из тех же функциональных свойств меда, которые действуют на человека (3), вполне могли развиться в контексте укрепления здоровья пчел.

ЭВОЛЮЦИОННОЕ ПРОИСХОЖДЕНИЕ ПРОИЗВОДСТВА МЕДА У ПЧЕЛ

Адаптивная ценность переработки и хранения пищи, вероятно, оказала давление отбора на геном медоносных пчел, как и у человека (155) — резкие смены рациона могут перестроить семейства генов для более специализированных функций (например, 59). Среди адаптаций к переработке меда — кодируемая геномом активность ферментов, поэтому сравнительная геномика (71) может помочь не только восстановить эволюционную историю производства меда, но и определить, получены ли предполагаемые полезные для здоровья свойства меда из кормовых источников окружающей среды, в результате кодируемого геномом биосинтеза или от симбиотических микробных партнеров.

Медоносные пчелы относятся к надсемейству Apoidea, которое включает апоидных ос и монофилетическую линию Anthophila, насчитывающую 20 000 видов пчел (131). Апоидные осы в первую очередь являются хищниками насекомых, хотя во многих линиях встречается кормление пыльцой, а по крайней мере одна сфецида (Krombeinictus sp.) снабжает личинок пыльцой и нектаром (153). Однако, за редким исключением, все пчелы являются специализированными потребителями пыльцы и нектара, как личинки, так и взрослые особи, и хранят эти продукты в той или иной форме для будущего использования личинками (131).

Хотя примерно 85% видов пчел являются одиночными, остальные 15% демонстрируют уровни группового образа жизни от общинного гнездования до сложных эусоциальных обществ с десятками тысяч особей. Хранение нектарной пищи развивалось одновременно с хранением пыльцы. У одиночных пчел смешивание пыльцы и нектара повышает эффективность транспортировки в поле и улучшает хранение в гнезде; вместе с железистыми выделениями нектар способствует образованию связных масс пыльцевых зерен, различающихся по текстуре и размеру (106). Таким образом, хранение пыльцы обязательно предполагает хранение нектара. Почти половину провизии одиночной люцерновой пчелы Megachile rotundata составляют сахара, получаемые из нектара (25), а поскольку 20% воды в провизии поступает из нектара, рацион личинок фактически составляет 2:1 нектар:пыльца. Хранение пыльцы с нектаром может также повысить ее усвояемость; пыльцевые зерна могут активно высвобождать большинство белков и свободных аминокислот почти сразу после инкубации в растворах сахара (55). Почти полное отсутствие сахарозы в провианте пчел, срезающих листья люцерны (несмотря на ее присутствие в нектаре люцерны), позволяет предположить, что в приготовлении провианта может участвовать инвертаза или сукраза, но личность и источник фермента (ферментов), ответственного за это превращение, неизвестны.

Переход к хранению нектара независимо от хранения пыльцы потребовал дополнительных ключевых инноваций, в частности, умения конструировать контейнеры для хранения. Поскольку вода способствует росту микроорганизмов, уменьшение содержания воды и/или защита емкостей антимикробными веществами повышает перспективы долгосрочного хранения жидких или полужидких материалов. Выстилание емкостей водонепроницаемыми материалами обеспечивает механизм хранения жидкости, снижая риски утечки и сопутствующей порчи, способствуя высокой влажности в среде гнезда.

Поведение, связанное со сбором смолы, которое встречается во многих линиях как социальных, так и одиночных пчел, также могло повысить эффективность хранения пыльцы, как за счет гидроизоляции, так и за счет предотвращения микробной колонизации провианта. Смоляные пчелы из рода Megachile (Megachilidae) — это одиночные виды, которые собирают растительные смолы для облицовки входов в гнезда и камер личинок; некоторые виды, гнездящиеся в полых стеблях, также используют смолы для строительства перегородок между ячейками и закрытия полости гнезда, как и несколько одиночных видов Hylaeus (Colletidae). Сбор смолы для гидроизоляции (или, возможно, дезинфекции) может быть преадаптацией к строительству контейнеров для хранения жидкостей у социальных видов.

Производство меда или медоподобных продуктов для хранения нектара ограничено эусоциальными видами. Cardinal & Danforth (26) определили, что «эусоциальность развилась однажды у общего предка корбикулятных Apidae, продвинутая эусоциальность развилась независимо у медоносных и безжальных пчел, и… эусоциальность была утрачена у орхидных пчел». Таким образом, эта филогения предполагает, что хранение значительных количеств нектара в виде меда могло развиваться независимо у медоносных и беззубых пчел. Действительно, хотя орхидные пчелы собирают нектар и пыльцу (например, 15, 120), известно, что они не делают мед и не хранят пищу вообще. Виды Bombus имеют годовой жизненный цикл и поэтому не перерабатывают и не хранят пищу для зимовки, хотя они строят восковые медовые горшочки для кратковременного хранения пищи. У шмелей, запасающих пыльцу, рабочие особи хранят пыльцу и нектар в отдельных восковых горшочках и кормят личинок срыгиваемой смесью этих продуктов (34). Хотя жидкость в нектарниках может быть очень густой, представляет ли она собой мед, неясно. Поведенческая переработка нектара минимальна; возвращающиеся фуражиры откладывают нектар непосредственно в горшки, а не передают его птенцам для активного испарения (118), и загустевшая жидкость в горшках с медом может быть просто результатом пассивного испарения.

Апины и мелипонины демонстрируют сходство в переработке нектара для длительного хранения — например, апины хранят переработанный нектар в восковых ячейках, часто выложенных прополисом, а мелипонины хранят переработанный нектар в горшочках из пчелиного воска в сочетании с растительными смолами. Мелипониновый мед биологически активен, обладает значительными антиоксидантными и антимикробными свойствами; как и в меде A. mellifera, антиоксидантная способность мелипонинового меда коррелирует с содержанием фенолов (158). Кроме того, в гипофарингеальных железах по крайней мере одного вида мелипонинового меда была обнаружена активность сукразы (33). Однако более высокое содержание воды и более низкое содержание сахара в мелипониновом меде делает его более подверженным быстрой порче, чем мед A. mellifera, в частности, зарастанию нитчатыми грибками (9). Таким образом, они менее пригодны в качестве источника кормовых запасов для поддержания здоровья колоний. Тем не менее, переработке и хранению пищи 500 или более видов медоносов уделялось значительно меньше внимания, чем переработке и хранению пищи A. mellifera (единственной среди семи видов Apis), и кажущаяся уникальность меда A. mellifera может просто отражать пробел в знаниях, который будет трудно устранить с логистической точки зрения.

ЭНДОГЕННЫЕ ФЕРМЕНТЫ И ПЕРЕРАБОТКА НЕКТАРА У APIS MELLIFERA

Гены детоксикации в геномах пчел

Потребление пыльцы, нектара и фитохимических веществ смолы требует биохимических возможностей для переработки фитохимических веществ, содержащихся во всех этих материалах. Пыльцевые зерна содержат флавоноиды, особенно кверцетин и каемпферол, растительные сигнальные вещества, которые опосредуют прорастание пыльцы и оплодотворение (98). Многие нектары содержат эти флавонолы, и как пыльца, так и нектар могут вносить свой вклад в содержание флавонолов в меде. Нектар розмарина, Rosmarinus officinalis, например, является основным источником каемпферола в меде пчел (54). Что касается прополиса, то, хотя источники смолы отличаются по химическому составу, флавоноиды, фенольные кислоты и фенольные альдегиды встречаются часто и в большом количестве; реже встречаются кумарины, стилбены и лигнаны (133). Сырой прополис может содержать до 17% флавоноидов. В то время как прополис из умеренной зоны, в основном из тополей и их родственников, содержит большое количество флаванонов и флавонов, прополис из тропических районов, как правило, имеет другой профиль, включая пренилированные флавоноиды, пренилированные производные p-кумаровой кислоты, производные кофеоилхиновой кислоты и лигнаны.

Среди генов P450 в геноме A. mellifera, кодируемых 46 генами в геноме медоносной пчелы, гены семейств CYP6 и CYP9 участвуют в детоксикации фитохимических веществ (11). Как установлено с помощью биопробы и/или молекулярного моделирования и докинга in silico, ферменты CYP6AS метаболизируют флавонолы, включая кверцетин, который повсеместно входит в состав нектара, меда, пыльцы, пчелиного хлеба, растительных смол и прополиса (90). Размер подсемейства CYP6AS варьирует у разных видов пчел, различающихся по степени социальности: Внутрисемейное разнообразие увеличивается со степенью социальности, варьируя от 7 у одиночной юго-восточной черничной пчелы Habropoda laboriosa и факультативно эусоциальной Lasioglossum albipes до 16 у видов Apis и 17 у многолетней эусоциальной Melipona quadrifasciatus (68). Эта закономерность отражает переход от краткосрочного хранения эфемерных низкокачественных продуктов к долгосрочному хранению концентрированной переработанной пищи. Диверсификация пищевых источников флавоноидов в более концентрированной форме в течение эволюционного времени могла привести к расширению подсемейства и возможной субфункционализации для обеспечения более специализированной фитохимической детоксикации.

Глюкозооксидаза/глюкозодегидрогеназа в геномах пчел

В нектаре и пыльце превращение глюкозы в глюконовую кислоту и перекись водорода препятствует росту микроорганизмов двумя способами — снижением pH и выделением перекиси водорода. GOXs (EC 1.1.3.4) — это оксидоредуктазные ферменты, которые действуют на первую гидроксильную группу молекул глюкозы. Эти ферменты тесно связаны и практически идентичны по структуре с глюкозодегидрогеназами (ГДГ), которые также являются оксидоредуктазными ферментами, действующими на первые гидроксильные группы молекул глюкозы и других сахаров. Однако, в отличие от ГДГ, GOXs уникальны тем, что используют кислород в качестве акцептора электронов, тогда как ГДГ используют широкий спектр акцепторов электронов в качестве кофакторов, включая NAD, FAD и пирролохинолинхинон (PQQ), но не кислород (48). Таким образом, GOXs отвечают за производство H2O2

Первоначально обнаруженный в грибах, GOX был впервые найден в животном источнике в гипофарингеальных железах A. mellifera (51). Позже этот фермент был связан с антибактериальной активностью меда через производство H2O2 и D-глюконовой кислоты из глюкозы (152). Бургетт (24) сообщил об активности GOX у девяти видов социальных перепончатокрылых из трех надсемейств — Formicoidea, Vespoidea и Apoidea, предположив, что этот фермент может присутствовать у большинства социальных насекомых, хранящих мед. Геном A. mellifera содержит один функционально признанный ген GOX (GB44549 в Amel_HAv3.1), который был выделен и охарактеризован (111) и расположен непосредственно рядом с GB44548, геном, предсказуемо аннотированным как GDH. Возможно, GOX произошел от предковой оксидоредуктазы, которая производила тандем из двух GDH, один из которых в дальнейшем изменился и функционализировался в GOX (79).

Анализ геномов 14 репрезентативных видов Hymenoptera, включая двух ос, двух муравьев и четырех пчел, показывает, что тандем из двух генов оксидоредуктазы, вероятно, существовал со времен последнего общего предка этих видов, причем эти два гена всегда находились в одном и том же геномном контексте (рис. 1). Однако, за исключением генов A. mellifera, оба тандемных гена из каждого генома прогностически аннотированы как GDHs с помощью автоматического конвейера аннотаций Национального центра биотехнологической информации, и ни у одного из других видов Hymenoptera не предсказаны GOXs. Дерево максимального правдоподобия аминокислотных последовательностей этих ферментов из 14 видов, однако, четко разделяет нисходящие и восходящие последовательности во всех геномах с высокой достоверностью, группируя все нисходящие последовательности с A. mellifera GOX и все восходящие последовательности с GDH, предполагая, что GOX может присутствовать во всех этих геномах (рис. 2). Это предположение согласуется с предсказанием (24), что функция GOX присуща большинству, если не всем, насекомым, собирающим пищу и нектар. Фактически, Sommeijer и др. (140) обнаружили H2O2 в провианте добывающей пчелы Colletes halophilus, олиголектического одиночного вида; отсутствие H2O2 в пищевой пыльце позволило этим авторам предположить, что GOX производится пчелами и добавляется в провиант личинок в качестве консерванта, необходимого из-за их полужидкой природы. A. cerana и Bombus terrestris — единственные два вида с одним геном в этой области, и оба их гена относятся к линии GOX. Это расхождение может быть связано либо с пропуском стоп-кодона при предсказании гена (особенно у B. terrestris, где ген необычно длинный), либо с потерей гена GDH (возможный сценарий для A. cerana).

Рис. 1 : Тандем GDH/GOX у 14 представителей Hymenoptera. Черная линия и цифры показывают геномный регион в пределах эшафота в соответствующей сборке. Розовые стрелки указывают на гомологи GDH, красные стрелки указывают на гомологи GOX, а синие стрелки указывают на структуру интронов/экзонов. Все последовательности были получены из Национального центра биотехнологической информации. Сокращения: GDH — глюкозодегидрогеназа; GOX — глюкозооксидаза.

Рисунок 2: Дерево максимального правдоподобия со 100 бутстреп-репликациями для 26 генов GDH и GOX у 14 видов Hymenoptera. Длина ветвей пропорциональна аминокислотным заменам, а цифры — бутстреп-значениям. Метками ветвей являются идентификаторы белков NCBI RefSeq, за которыми следует аннотация NCBI и вид. Дерево было создано с помощью RaxML v.7.2.8 (142). Сокращения: GDH — глюкозодегидрогеназа; GOX — глюкозооксидаза; NCBI — Национальный центр биотехнологической информации.

Выработка GOX медоносными пчелами, по-видимому, ограничена гипофарингеальными железами рабочих и высоко экспрессируется на разных стадиях развития. Экспрессия мРНК GOX прогрессивно увеличивается с возрастом, начиная с двух дней после расплода (чистильщики и медсестры) и достигая наивысшего уровня у переработчиков нектара и фуражиров. GOX очень сильно экспрессируется в гипофарингеальных железах случайно отобранных ульевых пчел, но экспрессия этого фермента не была обнаружена в нижнечелюстных железах, головных слюнных железах или слюнных железах грудной клетки (21), также GOX не экспрессируется в жировом теле медсестер через три или восемь дней после вылупления (30), в средней кишке (137) или во всем пищеварительном тракте у медсестер и фуражиров. В отличие от предыдущих результатов (79), эти исследования показали, что экспрессия GOX и соседних с ним транскриптов GDH несопоставима.

Другая точка зрения на производство глюконовой кислоты в меде (128) заключается в том, что бактерии, продуцирующие глюконовую кислоту, напрямую вносят глюконовую кислоту в мед; на сегодняшний день нет исследований, оценивающих относительный вклад эндогенных и экзогенных источников в уровень глюконовой кислоты в меде.

Инвертаза

Среди ферментов, добавляемых в нектар при его переработке в мед рабочими особями, есть сукразы, которые метаболизируют сахарозу во фруктозу и глюкозу. Поскольку сахароза является основным сахаром в большинстве нектаров, это превращение имеет решающее значение как для производства меда, так и для его функциональных свойств. Превращение сахарозы во фруктозу и глюкозу увеличивает осмотический потенциал меда, что повышает его антимикробные свойства и защищает его от порчи (тем самым продлевая срок его хранения). Сукроза отличается от других дисахаридов наличием α1-β2-гликозидной связи между двумя мономерами сахара, что делает ее одновременно α-D-глюкозидом и β-D-фруктофуранозидом, вследствие чего она является субстратом как α-глюкозидазы (ЕС 3.2.1.20, также известной как мальтаза или α-глюкозидаза), так и β-фруктозидазы (ЕС 3.2.1.26, также известной как инвертаза). Основное механистическое различие между этими двумя типами ферментов заключается в том, что дисахарид расщепляется по разные стороны от гликозидного атома кислорода (43). Из-за этого тонкого различия оба названия ферментов (т.е. инвертаза и α-глюкозидаза) используются как взаимозаменяемые для обозначения активности сукразы в секрете желез медоносной пчелы.

α-глюкозидазы (EC 3.2.1.20) широко распространены среди организмов, включая растения, грибы, бактерии, млекопитающих и насекомых. У насекомых α-глюкозидазы повсеместно присутствуют в средней кишке (145). У зрелых медоносных пчел-кормилиц гипофарингеальные железы занимают большую часть головы. Когда они превращаются в фуражиров, железы уменьшаются (154), и в уменьшенных гипофарингеальных железах была обнаружена активность сукразы (18). Кубо и др. (76) выделили приблизительно 70-килограммовый белок, избирательно синтезируемый в гипофарингеальных железах старых рабочих особей, и идентифицировали его как α-глюкозидазу; они использовали клонирование, секвенирование и RT-PCR, чтобы установить, что этот белок кодируется геном медоносной пчелы (GB43247), экспрессируемым специально в железах фуражиров и имеющим гомологию с возможной мальтазой из Aedes aegypti и Drosophila melanogaster (112). Три типа α-глюкозидазы были позже очищены из A. mellifera и из спелого меда (тип I, тип II и тип III), а иммуноблоттинг на тканях выявил α-глюкозидазу типа I в желудочке, α-глюкозидазу типа II в желудочке и гемолимфе, а α-глюкозидазу типа III только в гипофарингеальных железах и в меде. Эти три типа также имеют различные субстратные предпочтения, причем α-глюкозидаза типа III была единственной с кинетическим профилем, соответствующим деградации сахарозы (77). Мутационный анализ α-глюкозидазы A. mellifera типа III с использованием построенной in silico модели белка показал ее предпочтение сахарозы и мутации, необходимые для изменения этого предпочтения на мальтозу (99). Активная α-глюкозидаза также была очищена и охарактеризована из A. cerana indica (27).

Несмотря на широкое использование термина «инвертаза» в литературе по медоносной пчеле (например, 139), в отличие от α-глюкозидаз, в геноме A. mellifera или ее родственников нет доказательств наличия гена, кодирующего инвертазу (45). Также нет сообщений о кинетических параметрах активности сукразы во время созревания меда, которая отличается между инвертазами и α-глюкозидазами. Инвертазы (EC 3.2.1.26), также называемые β-фруктофуранозидазами, долгое время считались исключительно микроорганизмами и растениями. Это представление было опровергнуто после обнаружения генов инвертаз в геноме шелковой моли Bombyx mori (36), а затем и других видов Lepidoptera (64, 119). У B. mori этот ген, вероятно, был перенесен горизонтально от микроорганизма и обходит токсичность алкалоидных ингибиторов глюкозидазы из листьев Morus alba, имитирующих сахар, которые действуют на α-глюкозидазы средней кишки, но не на инвертазы (36). Позднее гены инвертазы были обнаружены еще у двух видов, оба из которых относятся к отряду Coleoptera: горного соснового жука (Dendoctronus ponderosa) (73) и изумрудного ясеневого жука (Agrilus planipennis) (160). То, что гены инвертазы у насекомых обычно не имеют интронов и не присутствуют у всех филогенетически близких видов, поддерживает теорию горизонтального переноса генов, хотя определенный эукариотический источник инвертазы насекомых был выявлен у Manduca sexta (119) путем демонстрации того, что последовательности генов инвертазы насекомых имеют 3′ нетранслируемую область и поли-А хвосты.

Поскольку инвертаза содержится в пчелином хлебе (75) и в протеомных анализах меда (14), существует возможность того, что созреванию меда способствует микробиом желез фуражира в рамках взаимовыгодного взаимодействия, которое может повысить эффективность переработки нектара. Харпел и др. (64) идентифицировали инвертазу в протеомном исследовании слюны другой питающейся нектаром бабочки Heliconius melpomene. Кроме того, как α-глюкозидазы широко распространены в природе, так и их ингибиторы, которые включают не только алкалоиды, но и флавоноиды растений, дрожжей и прополиса (78, 83, 122).

Помимо GOX и α-глюкозидазы, в меде регулярно обнаруживаются и другие ферменты. Давно известно о наличии амилазы (111), а также протеазы, ингибиторов сериновых протеаз и изоформ глюкозодегидрогеназы (82).

ФЕРМЕНТЫ РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ: КИСЛАЯ ФОСФАТАЗА И КАТАЛАЗА

Каталаза (EC 1.11.1.6), присутствующая почти во всех живых организмах, метаболизирует перекись водорода (H2O2) до воды и молекулярного кислорода. Совместное действие каталазы с другими ферментами, поглощающими H2O2, такими как пероксидазы и супероксиддисмутаза, имеет решающее значение для защиты клеток от окислительного повреждения, вызванного повышенным уровнем H2O2. Активность каталазы в меде была задокументирована более 100 лет назад (8, 56, 62), и ее присутствие было связано с пыльцой в меде и дрожжами, связанными с медом во время созревания (56). Предполагается, что активность каталазы в различных сортах меда (16, 66, 135) позволяет поддерживать уровень H2O2, образующегося в результате деятельности GOX, на уровне ниже токсичных концентраций. Таким образом, активность H2O2 в меде напрямую связана с уровнем GOX по сравнению с уровнем каталазы. Считается, что непероксидные фитохимические компоненты вносят вклад в антимикробную активность многих медов, в первую очередь мануки (Leptospermum scoparium: Myrtaceae), которая якобы обязана своей очень высокой антимикробной активностью преобразованию дигидроксиацетона нектара в метилглиоксаль в процессе переработки (95). Вестон (149), однако, предположил, что антимикробная активность мануки обусловлена избытком H2O2 в результате низкого содержания каталазы в пыльце мануки.

Первая сборка генома A. mellifera идентифицировала белок каталазы (GB11518, AAN76688.1), но предсказанный фермент не имеет обнаруживаемого секреторного сигнала (32). Однако каталаза A. mellifera, предсказанная в последней сборке генома A. mellifera, имеет длину 597 аминокислот и содержит потенциальный секреторный сигнал, предсказанный инструментом EMBOSS 6.5.7 sigcleave. Эта особенность, однако, не является окончательным доказательством того, что фермент секретируется, поскольку предсказания расщепления сигнала с помощью этого инструмента лишь на 75-80% точны для сигнальных пептидов эукариот.

Кислые фосфатазы (EC 3.1.3.2) представляют собой семейство повсеместно распространенных гидролазных ферментов, катализирующих гидролиз моноэфиров ортофосфата в кислых условиях (23). Активность кислой фосфатазы была обнаружена в меде несколько десятилетий назад (57); хотя анализ активности в пыльце, нектаре, настоящем меде и искусственном меде позволяет предположить, что активность обусловлена ферментами растительного происхождения (5, 151), для однозначного определения происхождения кислой фосфатазы меда недостаточно информации. Ни одно исследование еще не выделило и не охарактеризовало этот фермент на уровне аминокислот. Более того, Flanjak и др. (49) не обнаружили существенных различий в средней активности кислой фосфатазы между медом черной саранчи, каштана и медовой росы, последний из которых не получают ни из нектара, ни из пыльцы. Активность диастазы и GOX, известных как пчелиные производные, также не различалась между двумя монофлорными медами и медовой росой. Исследования по разделению и идентификации белков не дали четких доказательств наличия кислых фосфатаз, которые могли бы послужить основой для их характеристики (16, 17, 42).

В геноме A. mellifera имеется по меньшей мере семь кислых фосфатаз с более чем 24 предсказанными изоформами. Как и у человека, эти кислые фосфатазы имеют разное хромосомное происхождение и обладают различной аминокислотной гомологией. У медоносных пчел можно выделить четыре группы кислых фосфатаз: ядовитая кислая фосфатаза, ядовитая кислая фосфатаза-подобная, лизосомальная кислая фосфатаза и гомолог кислой фосфатазы типа 7. Как кислотные фосфатазы в меде соотносятся с этими категориями, пока не определено.

ПРОИСХОЖДЕНИЕ АНТИОКСИДАНТОВ МЕДА И УВЕЛИЧЕНИЕ ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТИ ЖИЗНИ

Фитохимический состав меда может способствовать увеличению продолжительности жизни благодаря своей антиоксидантной активности. Среди теорий старения социальных насекомых, в частности A. mellifera (7, 41), наиболее релевантной для дифференцированного долголетия рабочих особей является теория старения на основе окислительного стресса, которая утверждает, что необратимое накопление окислительных повреждений приводит к старению. В то время как различия в продолжительности жизни маток по сравнению с рабочими не зависят от экспрессии антиоксидантных генов (31), дифференциальная продолжительность жизни рабочих соответствует постулатам гипотезы окислительного стресса. Зимние пчелы живут до 24 недель во взрослом состоянии, тогда как продолжительность жизни летних фуражиров составляет три-четыре недели (7). У летних рабочих переход от работы в улье к добыче корма является центральной переменной старения медоносной пчелы, хотя хронологический возраст, независимо от поведенческого состояния, также вносит свой вклад в старение (127). С увеличением продолжительности жизни связано уменьшение количества перекисных (полиненасыщенных) жирных кислот и, соответственно, уменьшение окислительного повреждения (63).

Влияние компонентов меда на продолжительность жизни происходит через регуляцию генов, связанных с продолжительностью жизни. В нескольких исследованиях (81, 93) было показано, что потребление п-кумаровой кислоты личинками медоносных пчел повышает регуляцию вилочковой головки (FOXO) в 2,38 раза; FOXO был связан с долголетием пчел, поскольку его гомолог в Caenorhabditis elegans понижает регуляцию генов, сокращающих жизнь, и повышает регуляцию антиоксидантных ферментов (каталаза, супероксиддисмутаза) в Culex pipiens. Кроме того, FOXO у D. melanogaster при сверхэкспрессии в жировом теле увеличивает продолжительность жизни самок (53). Хризин, содержащийся как в меде, так и в прополисе (88), добавленный в рацион взрослых D. melanogaster, увеличивал среднюю продолжительность жизни самок на 12% и максимальную продолжительность жизни на 22%, но не оказывал эффекта увеличения продолжительности жизни на самцов (80). У самок мух, потреблявших рацион, в который был добавлен хризин, уровень экспрессии Hsp70 был снижен на 82% по сравнению с мухами, питавшимися без добавок. Хотя считается, что Hsp70 обладает геропротекторными свойствами, снижение уровня экспрессии Hsp70 после потребления хризина может быть биомаркером более молодого биологического возраста, учитывая, что мухи с более низким уровнем Hsp70 живут дольше, чем мухи с более высоким уровнем.

Компоненты меда могут также увеличивать продолжительность жизни непосредственно за счет своей антиоксидантной активности. Многие антиоксидантные фенолики в меде могут быть способны нейтрализовать реактивные формы кислорода, которые повреждают белки, ДНК и жирные кислоты, что приводит к гибели клеток. Антиоксидантная способность меда зависит от источника нектара; в первом исследовании, изучавшем эту взаимосвязь, Френкель и др. (50) обнаружили 20-кратные различия в антиоксидантной способности 14 монофлорных медов. Интерес к меду как к функциональному продукту питания для человека заметно возрос с признанием его антиоксидантного содержания; поиск в основной коллекции Web of Science (3 марта 2020 года) дал около 400 статей с названиями, включающими слова «антиоксидант» и «мед». Однако только 38 из них включали в качестве темы «Apis mellifera»; преобладающее число работ посвящено здоровью и питанию человека (например, 2), а значение антиоксидантной активности меда для продолжительности жизни медоносной пчелы (или каких-либо других преимуществ для здоровья) не очень хорошо известно.

Любопытно, что исследования, изучающие, может ли сам мед, а не его отдельные компоненты, увеличить продолжительность жизни, чаще проводятся на паразитоидных осах, чем на медоносных пчелах, которые его производят; большинство таких исследований направлено на улучшение массового разведения паразитоидов для биологического контроля. Харви и др. (65) сравнили признаки жизненной истории Gelis agilis (Ichneumonidae), выращенных на меде, имитаторе медового сахара или глюкозе. Самки G. agilis, потреблявшие мед, произвели в два раза больше потомства, чем те, которые выращивались на других диетах; продолжительность жизни самок сократилась только на диете, имитирующей мед с сахаром, что позволяет предположить вклад компонентов меда, помимо сахаров, в увеличение продолжительности жизни и размножения.

Влияние отдельных компонентов меда с высокой антиоксидантной способностью на продолжительность жизни взрослых пчел оценивалось чаще, чем влияние неповрежденного меда. Ляо и др. (84) провели серию анализов продолжительности жизни пчел на сахаро-казеиновой белковой диете с добавлением п-кумаровой кислоты, кверцетина и этих двух фитохимических веществ вместе. Диета с п-кумаровой кислотой увеличила продолжительность жизни на 17,6%, а диета с кверцетином — на 6,2%; однако пчелы, потреблявшие эти два фитохимиката вместе, не испытывали увеличения продолжительности жизни. Аналогичные эффекты были отмечены Вонгом и др. (156) с теми же фитохимическими веществами; пчелы, потреблявшие п-кумаровую кислоту, жили дольше, чем пчелы, потреблявшие контрольный рацион, хотя у пчел, потреблявших рацион, содержащий как п-кумаровую кислоту, так и кверцетин, продолжительность жизни сократилась. Бернклау и др. (12) продемонстрировали, что четыре фитохимических вещества — кофеин, галловая кислота, каемпферол и п-кумаровая кислота — увеличивают продолжительность жизни взрослых пчел в экологически приемлемых концентрациях. Хотя все эти фитохимические вещества встречаются в меде, кофеин распространен менее широко и известен в основном из нектара цитрусовых и кофейного дерева (157). Существует мало исследований о влиянии содержания антиоксидантов в меде на продолжительность жизни рабочих или здоровье колонии на уровне колонии.

НЕПЕРОКСИДНАЯ АНТИМИКРОБНАЯ АКТИВНОСТЬ МЕДА

В контексте здоровья человека мед давно ассоциируется с антибактериальной активностью, и его активность против патогенов человека хорошо документирована. Ингибирующий эффект был задокументирован в отношении планктонных бактерий, а мед (особенно мед манука) также может нарушать кворумное зондирование бактерий и повреждать как одновидовые, так и многовидовые биопленки (110). В течение десятилетий антимикробная активность меда объяснялась содержанием в нем H2O2. Однако за последние 30 лет были выявлены компоненты меда, полученные из фитохимических веществ, собранных в кормах, и из эндогенных секреций, которые наделяют мед антимикробными свойствами, помимо тех, которые связаны с H2O2. Среди пчелиных компонентов — пять основных белков маточного молочка (82), антимикробный пептид (AMP) гименоптаецин (46) и AMP дефенсин-1 (42). Дефенсин-1, вырабатываемый гипофарингеальными железами пчел-кормилиц, активен против Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus и Paenibacillus larvae (американская плодожорка) (144). Белки маточного молочка, также вырабатываемые гипофарингеальной железой, составляют большинство белков, содержащихся в меде (42, 126). Самый многочисленный из них, MRJP1, производит три джеллина, AMP, которые вызывают лизис клеточной стенки и гибель бактерий и, таким образом, вероятно, ответственны за большую часть бактерицидной активности меда (19).

Что касается здоровья пчел, то анализы антимикробной активности меда против экологически значимых патогенов пчел немногочисленны. Erler & Moritz (47), например, продемонстрировали ингибирование полифлорным медом бактериальных штаммов американского фульбруса (P. larvae) и европейского фульбруса (Melissococcus plutonius), а также специфическое ингибирование штаммов подсолнечником и медом черной саранчи. Nafea и др. (100) протестировали четыре монофлорных меда [Citrus spp., клевер (Trifolium alexandrium), хлопок (Gossypin [sic] barbadens) и камфора] против американской плодожорки и обнаружили различия в эффективности, при этом клевер и хлопок показали самую высокую ингибирующую активность.

Антимикробная активность фитохимических веществ меда исторически была задокументирована в анализах с человеческими патогенами (144), поэтому ее экологическое значение для здоровья медоносных пчел не всегда ясно. Среди фитохимических веществ, связанных с антимикробной активностью, есть фенольные кислоты, флавонолы, флаваноны, флавоны и изофлавоны (110). Что касается активности фитохимических веществ меда против патогенов пчел, Бернклау и др. (12) исследовали влияние кофеина, галловой кислоты, каемпферола и п-кумаровой кислоты на взрослых пчел, зараженных микроспоридией Nosema ceranae, и сообщили, что, за исключением галловой кислоты, все они уменьшили количество спор по сравнению с контролем, особенно при низких концентрациях.

Поскольку в течение сезона пчелы производят и хранят мед из широкого спектра нектара, существует возможность того, что пчелы самостоятельно выбирают оптимальные типы меда для борьбы с микробными проблемами. Пчелы-кормилицы, зараженные микроспоридийным паразитом N. ceranae, которым был предоставлен выбор меда из одного источника (липа, черная саранча, роса, подсолнечник), избирательно потребляли подсолнечный мед, который обладал самой высокой антимикробной активностью и который, если потреблялся исключительно в пищу, снижал распространенность паразита уже через шесть дней (52). Хотя конкретные компоненты, ответственные за противогрибковые свойства, не были идентифицированы, Герман и др. (52, с. 1782) исключили сахарный профиль и вязкость и предположили, что «вполне возможно, что именно разнообразие медовых запасов способствует иммунитету колонии на уровне колонии против всего спектра патогенов, которым она подвергается». Среди флавоноидов, обнаруженных в подсолнечном меде, — пиноцембрин, пинобанксин, хризин, галангин, кверцетин и, в меньших количествах, тектохризин и каемпферол (129). Некоторые из этих соединений, по отдельности и в комбинации, проявляют выраженную противогрибковую и антибактериальную активность (132) и могут способствовать эффективности этого меда против инфекции Nosema.

В целом, противогрибковая активность меда связана с фитохимическими веществами, которые, вероятно, происходят из прополиса. Из основных фитохимических веществ, обнаруженных в меде в северных широтах — пинобанксин, пиноцембрин, кверцетин, хризин и галангин (72) — лишь немногие встречаются в цветочных нектарах. Однако все они широко распространены в прополисе (130). Основные фенольные соединения, обнаруженные в меде, являются флавоноидами и включают флавонолы (кверцетин, каемпферол, галангин), флаваноны (пиноцембрин, пинобанксин) и флавоны (хризин, лютеолин) (72, 123). Эти соединения характерны для прополиса умеренной зоны и связаны с фунгистатическими свойствами (133). Прополис из тропических регионов отличается по составу и содержит в основном пренилированные производные п-кумаровой кислоты и флавоноиды, а также производные кофеоилхиновой кислоты, также связанные с фунгистатическими свойствами (87).

Хотя известно, что прополис сам по себе не употребляется в пищу (138), тот факт, что общие компоненты прополиса встречаются в широком разнообразии медов в разных географических регионах (146), позволяет предположить, что употребление меда в пищу может представлять собой основной путь потребления пчелами соединений, получаемых из прополиса. Многие из наиболее распространенных компонентов прополиса, входящих в состав меда, растворимы в воде; кроме того, хотя прополис сам по себе отпугивает пчел, при добавлении экстракта в сахарную конфету вкусовые качества заметно повышаются, и он «охотно потребляется» (38).

ПОВЫШАЮЩАЯ ИММУНИТЕТ АКТИВНОСТЬ КОМПОНЕНТОВ МЕДА

Центральное место в гуморальном иммунитете насекомых занимают АМП, регулируемые IMD и Toll путями, которые защищают от разнообразных патогенов, включая вирусы, бактерии, грибки и простейшие (96, 116). Некоторые компоненты меда повышают уровень нескольких AMP; например, p-кумаровая кислота повышает уровень апидаецина у взрослых пчел (92) и пяти дополнительных AMP у трехдневных личинок пчел в 25 раз (93). Среди других генов иммунитета, повышаемых p-кумаровой кислотой, были LYZ, индуцированный в 1,75 раза; белок распознавания b-1,3-глюкана, повышенный в 1,68 раза; и белок распознавания пептидогликана S2, повышенный в 1,87 раза.

Палмер-Янг и др. (116) аналогичным образом показали, что шесть фитохимических веществ — амигдалин (цианогенный гликозид), анабазин, никотин (алкалоид), аукубин, каталпол (иридоидный гликозид) и тимол (терпен) — увеличивали экспрессию генов AMP от 12,9 до 61 раза у старых пчел через неделю после их употребления, причем больше всего увеличивалась экспрессия гименоптацина. Функциональное значение этой регуляции иллюстрируется снижением до 99,8% вируса деформации крыльев менее чем через сутки после употребления фитохимикатов.

Абсцизовая кислота, растительный гормон, содержится во многих видах меда. Вересковый мед (Erica spp.) содержит два изомера, цис,транс-абсцизовую кислоту и транс,транс-абсцизовую кислоту, с общей концентрацией от 2,5 до 16,6 мг/100 г меда. Оба изомера в изобилии содержатся в цветках эрики (102). Потребление абсцизовой кислоты способствует здоровью колонии несколькими способами, в том числе путем повышения эндогенного уровня ABA в организме пчел, стимулирования реакции гемоцитов на распознавание несамостоятельности, улучшения заживления ран и активации гранулоцитов и плазмоцитов, а также повышения устойчивости к пестицидам.

СОСТАВЛЯЮЩИЕ МЕДА И УСТОЙЧИВОСТЬ К ТОКСИНАМ

Было доказано, что потребление меда пчелами повышает толерантность к попадающим в организм природным и синтетическим токсинам. По сравнению с потреблением кукурузного сиропа с высоким содержанием фруктозы или сахарозы, потребление меда повышает выживаемость взрослых пчел в присутствии афлатоксина B1, микотоксина, производимого Aspergillus (109). Потребление экстрактов меда, пыльцы или прополиса повышает уровень генов CYP6AS, кодирующих ферменты, которые метаболизируют кверцетин (69, 90), и генов CYP9Q, кодирующих ферменты, которые метаболизируют кверцетин, акарициды кумафос и бифентрин (91), а также неоникотиноидные инсектициды (89).

Специфические компоненты экстракта меда, которые индуцируют экспрессию CYP9Q3 (92), включают три фенольные кислоты (кофейную, коричную и п-кумаровую), флавон (хризин), флавонол (галангин) и два флаванона (нарингенин, пиноцембрин). Фенольная кислота p-кумаровая кислота известна не только из различных видов меда, часто в качестве основного компонента [например, гречишного (117)], но и из прополиса (4). Анализ РНК-секвенирования (RNA-Seq) взрослых рабочих (92) и личинок (93) показал, что p-кумаровая кислота повышает уровень ряда генов детоксикации, включая многочисленные гены CYP6 и CYP9 у личинок и взрослых, а также гены эстераз, трансфераз и транспортеров у взрослых. В средней кишке медсестры гены CYP6AS были повышены в 1,90-3,11 раза под действием п-кумаровой кислоты, а CYP9Q3 — в 2,55 раза; в трехдневных личинках шесть генов CYP6AS были повышены в 1,9-45 раз, а шесть генов CYP9 — в 1,46-3,12 раз. В отдельном исследовании (94), RNA-Seq анализ экспрессии генов у личинок, выращиваемых в течение трех дней на диете с низким и высоким уровнем кверцетина, показал, что среди 28 генов P450 в клане CYP3 (к которому принадлежат основные детоксицирующие P450), семь были повышены обоими уровнями кверцетина, два (CYP6AS17 и CYP9R1) были повышены низким уровнем кверцетина, а четыре (CYP6AS1, CYP9Q1, CYP9Q2 и CYP9Q3) были повышены высоким уровнем кверцетина.

То, что фитохимическая регуляция этих P450 имеет функциональное значение для усиления метаболизма пестицидов, было установлено в нескольких исследованиях. Потребление п-кумаровой кислоты в диете на основе сахарозы увеличило метаболизм кумафоса в средней кишке примерно на 60% (91). Ляо и др. (84) показали увеличение продолжительности жизни взрослых пчел, потребляющих два пиретроидных пестицида в сочетании с п-кумаровой кислотой или кверцетином, а Вонг и др. (156) продемонстрировали, что оба соединения увеличивают продолжительность жизни взрослых пчел, потребляющих имидаклоприд, хотя реакция была двухфазной, с отрицательным эффектом при более высоких концентрациях. Миттон и др. (97) добавляли в рацион пчел п-кумаровую кислоту и индол-3-уксусную кислоту, чтобы определить влияние этих кислот на выживаемость взрослых пчел и их способность переносить тау-флувалинат. Добавление любого из этих соединений привело к увеличению выживаемости пчел, подвергшихся воздействию тау-флувалината, примерно на 20%, причем п-кумаровая кислота повысила активность цитохрома P450s и глутатионредуктазы у обработанных и контрольных пчел.

Помимо регуляции генов иммунитета, абсцизовая кислота (ABA) может повысить толерантность взрослых пчел к карвакролу, монотерпеноидному фенолу, используемому некоторыми пчеловодами в качестве антибактериального средства, и щавелевой кислоте, используемой пчеловодами в качестве акарицида (103). Потребление ABA только что появившимися и трехдневными пчелами-кормилицами повышало значения LC50 для щавелевой кислоты от двухкратного до 10-кратного. Поскольку добавление ABA увеличило активность каталазы на 40%, Негри и др. (103, 104) предположили, что ABA действует для снижения токсичности через усиление активности каталазы, которая может противодействовать реактивным видам кислорода, генерируемым токсинами.

КОМПОНЕНТЫ МЕДА КАК РЕГУЛЯТОРЫ РАЗВИТИЯ

Определение касты у медоносных пчел зависит от рациона питания; в то время как личинки самок, предназначенные для королевы, не получают никакой другой пищи, кроме маточного молочка (смеси железистых выделений) от пчел-кормилиц, личинки, предназначенные для рабочих, в течение первых трех дней жизни питаются желе, а затем получают желе, смешанное с медом и пчелиным хлебом. Таким образом, фитохимические вещества в этих растительных кормах способны влиять на пути развития. Добавление п-кумаровой кислоты в рацион маточного молочка во время выращивания личинок in vitro приводит к получению взрослых самок с неполным развитием яичников (93). Это торможение развития яичников может быть результатом изменения экспрессии генов под действием п-кумаровой кислоты. В сигнальном пути hippo, который участвует в регуляции размера органов, более половины из 46 генов пути были дифференциально отрегулированы у личинок, потребляющих п-кумаровую кислоту, причем 7 из 21 гена были повышены более чем в 2 раза. Также от 1,3 до 2,7 раз были повышены 14 генов, участвующих в дифференциации касты рабочих и королев; основные белки маточного молочка были понижены при потреблении р-кумаровой кислоты по сравнению с контрольной диетой (с понижением гена MRJP1, или роялактина, до 6,6 раз).

Помимо п-кумаровой кислоты, полученной из растений, в меде также содержатся растительные микроРНК (58). Чжу и др. (161) сообщили, что потребление растительных микроРНК личинками снижает скорость развития, размер яичников и размер тела и тем самым способствует развитию в рабочих особей, а не в королев, используя форму кастрации RNAi. Хотя основным источником пищевых микроРНК, по-видимому, является пыльца в пчелином хлебе, не исключен определенный вклад в регуляцию развития микроРНК, присутствующих в меде, входящем в состав пчелиного хлеба.

СОСТАВЛЯЮЩИЕ МЕДА И ВЫЖИВАНИЕ ПРИ ЗИМОВКЕ

Хранящийся мед необходим для выживания зимующих медоносных пчел в умеренном климате, и есть некоторые доказательства того, что составляющие меда, помимо углеводов, способствуют устойчивости к холоду. Дополнительный ABA повышает как врожденный иммунный ответ, так и выживаемость колоний медоносных пчел при низких температурах (25° C), которые в противном случае снижают выживаемость почти наполовину по сравнению со стандартными температурами (34° C) (102). Дополнительный ABA также ускоряет развитие личинок, испытывающих холодовой стресс, возможно, за счет повышения транскрипции Hex7b, а также вителлогенина (vg) и белка теплового шока 70 (hsp70), которые реагируют на холодовой стресс (124). Негри и др. (103) предположили, что ABA координирует стрессовые реакции, включая воздействие холода и ранение, через путь Toll.

ВЫВОДЫ И ВОЗМОЖНОСТИ БУДУЩИХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Судя по характеру производимого ими меда, медоносные пчелы являются уникальными среди животных в своей способности перерабатывать нектар и упаковывать его для длительного хранения. Тем не менее, выявление геномных особенностей производства меда остается труднодостижимой целью, как и понимание эволюции характерного поведения и физиологических адаптаций, связанных с этим процессом. Более того, большая часть общепринятых представлений о меде не подтверждается большим количеством литературы. Оценка геномов пчел показывает, что активность, исторически приписываемая инвертазе при изготовлении меда, на самом деле может производиться α-глюкозидазой, а активность кислой фосфатазы и каталазы в некоторой степени может быть обусловлена эндогенными, а не экзогенными ферментами. Более того, хотя компоненты меда могут оказывать поразительное воздействие на поведение отдельных пчел, включая обучение и память (114), влияние таких поведенческих эффектов на уровне колонии оценивается редко, а механизмы, лежащие в основе краткосрочных поведенческих реакций, нелегко выяснить с помощью геномных инструментов.

Ограничение литературы по химии меда заключается в том, что в ней преобладают усилия по выявлению уникальных компонентов для аутентификации цветочного происхождения и попытки охарактеризовать отдельные компоненты, ответственные за определенный тип биологической активности. Таким образом, мало внимания уделяется взаимодействию между сотнями уже идентифицированных компонентов меда и потенциальным синергическим или антагонистическим эффектам между компонентами, которые могут происходить не только от цветов, но и от самих пчел, от смол растительного происхождения в прополисе и, возможно, от микробиомов, связанных с пчелами. Разнообразие биологической активности меда зависит не только от разнообразия фитохимических веществ, которые пчелы собирают из окружающей среды, но и от взаимодействия между этими фитохимическими веществами и химическими веществами нерастительного происхождения, и практически ни одно исследование не проверяло взаимодействие между этими сотнями совместно встречающихся веществ.

Понимание того, как фитохимическое разнообразие влияет на благотворное воздействие меда на здоровье как отдельных пчел, так и колонии в целом, имеет значение для будущего пчеловодства. Из-за интенсификации сельскохозяйственных монокультур, урбанизации и других форм деградации среды обитания медоносные пчелы часто не могут найти достаточное количество растительных ресурсов для процветания и, в случае необходимости, собирают и потребляют различные произведенные человеком вещества, которые резко отличаются по составу от их естественной пищи (28, 121). Более того, практика пчеловодства, которая заменяет мед сахарозой или кукурузным сиропом с высоким содержанием фруктозы во времена нехватки нектара, может повлиять на здоровье пчел, изменяя экспрессию множества генов, участвующих в метаболизме белков и снижении окисления по сравнению с медом (150). Даже если содержание сахаров в натуральной и человеческой пище одинаково, отсутствие фитохимического профиля меда может иметь последствия для поддержания иммунитета, детоксикации и терморегуляции. Поскольку сбор смолы ограничен более узким кругом растительных источников, чем нектар, отсутствие подходящих источников также может привести к потенциально дезадаптивному поведению, включая сбор асфальта для включения в прополис (6); влияние присутствия компонентов асфальта и отсутствия компонентов смолы, которые обычно включаются в мед, еще не было оценено.

В целом, мед интегрирован практически во все аспекты жизни медоносных пчел; что еще более важно, его состав способен повлиять или смягчить самые постоянные проблемы, которые поразили современное пчеловодство за последние три десятилетия — а именно, пестициды, патогены, паразиты и плохое питание. Понимание того, как медоносные пчелы используют мед в качестве функциональной пищи, может принести значительные дивиденды в улучшении здоровья медоносных пчел и дать новое понимание важности хранения пищи в социальной эволюции.

Ссылки:

1.Adler LS. 2000. The ecological significance of toxic nectar. Oikos 91:409–20

Crossref Web of Science ®Google Scholar

Article Locations:

Article LocationArticle Location

More AR articles citing this reference

2. Ahmed S, Sulaiman SA, Baig AA, Ibrahim M, Liaqat S, et al. 2018. Honey as a potential natural antioxidant medicine: an insight into its molecular mechanisms of action. Oxid. Med. Cell. Longev. 2018:8367846