Медоносные пчелы увеличивают социальную дистанцию при встрече с эктопаразитом Varroa destructor

Аннотация

Социальное дистанцирование в ответ на инфекционные заболевания — это стратегия, демонстрируемая человеком и нечеловеческими животными для противодействия распространению патогенов и/или паразитов. Колонии медоносных пчел (Apis mellifera) являются идеальной моделью для изучения этого поведения из-за компартментализованной структуры этих обществ, сформировавшейся под воздействием паразитов и необходимости обеспечения эффективного функционирования. Здесь, используя комбинацию пространственного и поведенческого подходов, мы исследовали, вызывает ли присутствие эктопаразита клеща Varroa destructor изменения в социальной организации колоний A. mellifera, которые могут уменьшить распространение паразита. Наши результаты показали, что медоносные пчелы реагируют на вторжение V. destructor, изменяя использование пространства и социальные взаимодействия, увеличивая социальную дистанцию между молодыми (медсестры) и старыми (фуражиры) когортами пчел. Эти результаты убедительно свидетельствуют о поведенческой стратегии, о которой ранее не сообщалось у медоносных пчел, чтобы ограничить передачу паразита внутри колонии.

Введение

Социальные насекомые особенно уязвимы для патогенов и паразитов благодаря плотной сети контактов между высокородственными сородичами и большому количеству пищи, хранящейся в гнезде при относительно стабильных условиях окружающей среды (1). Чтобы противостоять давлению болезней, социальные насекомые выработали, помимо индивидуальных иммунных реакций, множество форм социального иммунитета, т.е. стратегий, основанных на сотрудничестве отдельных членов группы (2). Последние проявляются на поведенческом, физиологическом и организационном уровне и могут действовать синергетически, чтобы избежать вторжения, внедрения и размножения патогенов или паразитов внутри колонии (2, 3).
Особенно важным аспектом является организация колонии, т.е. схема социальных взаимодействий между членами колонии в пространстве и времени. В то время как эргономическая оптимизация выбирает плотные и взаимосвязанные сообщества (4), давление патогенов и/или паразитов является решающим фактором, определяющим организацию колонии насекомых (1), которая предпочитает механизмы, ограничивающие взаимодействие между особями для снижения риска распространения болезни (5-7). Поэтому можно предсказать, что скорость контактов между сородичами будет ограничена пространственной и поведенческой компартментализацией различных когорт особей в соответствии с их возрастом, ролью (кастой) и деятельностью (задачей) (6-8). Такой «конститутивный организационный иммунитет» имеет место и в отсутствие вызова болезни, действуя таким образом как профилактическая иммунная защита (2, 6, 8). Наглядная демонстрация этой теоретической модели на социальных насекомых была дана Строймейтом и др. (9).
Будучи под угрозой десятков вредителей и болезней (10), колонии медоносных пчел могут извлечь выгоду из конститутивного организационного иммунитета. Анализ пространственных и социальных сетей с высоким разрешением показал, что колонии медоносных пчел организованы в два основных отсека: внешний отсек занят фуражирами (старыми пчелами), сгрудившимися у входа в улей, а внутренний отсек населен медсестрами (молодыми пчелами) с королевой, которые проводят большую часть времени на расплодных ячейках (11). Такая пространственная сегрегация внутри колонии приводит к меньшей частоте взаимодействий между двумя отсеками, чем внутри каждого из них, и позволяет защитить наиболее ценных особей, т.е. маток, молодых пчел и расплод, от внешней среды и, следовательно, от проникновения болезней (5, 11).
Этот конститутивный тип иммунной защиты может быть дополнен реактивными стратегиями, т.е. изменением социальных сетей колонии и использования пространства внутри гнезда при появлении паразита или патогена (индуцированный организационный иммунитет), с целью дальнейшего снижения риска распространения заболевания (8, 12). Эта гипотеза была недавно подтверждена на примере муравья Lasius niger, зараженного грибковым патогеном Metarhizium brunneum, который вызвал поведенческие изменения не только среди подверженных патогену фуражиров, но и среди их сородичей, тем самым снижая индивидуальный риск заражения (9). Аналогичным образом, колонии медоносных пчел, подвергшиеся экспериментальной инокуляции израильского вируса острого паралича, сократили социальные контакты между членами колонии, что свидетельствует об адаптивной социальной иммунной реакции хозяев для снижения передачи патогена (13).

Эти исследования продемонстрировали индуцированный организационный иммунитет в ответ на микробные заболевания, но у нас все еще нет доказательств такого реактивного социального иммунного ответа, когда колонии социальных насекомых подвергаются нападению членистоногих эктопаразитов, таких как клещи. В гнездах социальных насекомых обитает широкий спектр клещей (14), некоторые из которых могут оказывать существенное влияние на жизнеспособность колонии (15-19). Varroa destructor является одной из самых серьезных угроз для медоносных пчел во всем мире (17, 19) и сыграл фундаментальную роль в сокращении колоний медоносных пчел по всему Северному полушарию в последние десятилетия (20, 21). Этот клещ вызывает ряд пагубных последствий для пчел на уровне отдельных особей и колоний (22, 23), включая передачу пчелиных вирусов (24). Проникновение паразита внутрь незараженных колоний обычно происходит через фуражиров той же колонии, которые могут встретить паразита на цветах (25), а также через фуражиров из чужих колоний вследствие дрейфа или грабежа (26). Для размножения клещу-находке необходимо попасть в расплодную ячейку вместе со зрелой личинкой пчелы (17, 19). В конце стадии куколки медоносной пчелы материнский клещ и его потомство выйдут из ячейки вместе с появившейся пчелой (17). Затем происходит рассеивание паразита внутри улья путем паразитирования в основном на пчелах-кормилицах (форетическая фаза) (27).
В данной работе мы исследовали, вызывает ли присутствие эктопаразита клеща V. destructor в колониях медоносных пчел изменения в стратегиях социального иммунитета, которые могут уменьшить распространение паразита. Мы сосредоточились на использовании пространства и моделях социального взаимодействия, которые являются двумя характеристиками, влияющими на организационный иммунитет (11). Наше исследование проводилось на двух уровнях: наблюдение за целыми колониями, подвергшимися естественному заражению V. destructor в полевых условиях, для наблюдения широкомасштабных изменений в специфических стратегиях иммунной защиты, и наблюдение с высоким разрешением за индивидуальным поведением в небольших группах пчел в клетках, экспериментально зараженных V. destructor в лаборатории, для оценки тонкомасштабных изменений в социальном поведении в результате заражения Varroa. Эти два уровня позволили нам проверить конкретные предсказания, вытекающие из теории социального иммунитета (2).
В эксперименте с целой колонией мы провели сравнительные наблюдения за поведением зараженных варроа и свободных от варроа колоний, помещенных в наблюдательные ульи. Различный уровень заражения в двух экспериментальных группах был получен путем применения различных акарицидных обработок в случайно выбранных ульях. Мы наблюдали за двумя типами поведения, сильно вовлеченными в рассеивание паразита (5): кормовые танцы и аллогруминг. Оказавшись внутри улья, фуражиры могут исполнять фуражировочные (хороводные и виляющие) танцы, чтобы сообщить точное местоположение источника пищи другим фуражирам (последователям танца) (28). Фуражиры предпочитают танцевать на сотах около центра улья, скапливаясь в областях нижней половины, ближайших к входу (29). Поскольку фуражиры представляют собой важный путь проникновения V. destructor в колонию, было бы выгодно ограничить социальные контакты между фуражирами и другими членами колонии, когда присутствует клещ. Поэтому можно предсказать, что под давлением паразита фуражиры изменят свое использование пространства, пространственно сместив свои танцы к периферии колонии (предсказание 1).
Аллогруминг — это социальное поведение, при котором пчела удаляет инородные частицы и паразитов с другой пчелы (30, 31). Apis mellifera способна удалять и убивать варроа посредством аллогруминга, хотя и менее эффективно, чем Apis cerana (32). Как правило, это спорадическое поведение проявляется у молодых пчел в возрасте от 6 до 11 дней (33), когда они в основном действуют как пчелы-кормилицы (34). При заражении V. destructor пчелам, вероятно, лучше сосредоточить усилия по аллогрумингу в ядре колонии, т.е. в области гребня с расплодом, где остаются пчелы-кормилицы и где могут чаще появляться новые пчелы, несущие клещей (предсказание 2). Таким образом, мы сделали общий прогноз о противоположном характере кормовых танцев и аллогруминга в зараженных колониях, с центробежными и центростремительными сдвигами в их появлении: Мы ожидали, что кормовые танцы будут преобладать на периферии, а аллогруминг будет сосредоточен в ядре колонии.

В лабораторном эксперименте наблюдения с высоким разрешением за индивидуальным поведением в экспериментально зараженных группах пчел и пчел без варроа проводились на молодых пчелиных когортах (1-дневные пчелы), поскольку они представляют собой средство, с помощью которого постпионерные поколения клещей выходят из ячеек и распространяются в гнезде (17, 19). Мы проанализировали, повлияло ли присутствие Varroa на индивидуальное социальное поведение и как это отразилось на сплоченности мелких социальных сетей, сосредоточившись на трех распространенных видах социального поведения, которые также вовлечены в борьбу с клещом и его распространение: аллогруминг, антеннация и трофаллаксис. Антеннация — это основной метод, используемый медоносными пчелами для распознавания сородичей (35). Трофаллаксис — это процесс, при котором пчела раздает жидкий корм другим пчелам, причем 1-дневные рабочие особи чаще становятся пчелами-донорами (36). Мы предсказывали, что в условиях давления паразитов мы обнаружим различные модели индивидуального социального поведения (предсказание 3), в соответствии с теорией социального иммунитета (2). Более конкретно, мы предсказывали увеличение аллогруминга и уменьшение антеннации и трофаллаксиса, поскольку первый обычно ограничивает распространение болезни, в то время как два последних обычно увеличивают его. Баланс между увеличением аллогруминга и уменьшением антеннации и/или трофаллаксиса повлияет на сплоченность социальной сети (т.е. насколько хорошо группа связана) в зараженных группах (предсказание 4). Поскольку аллогруминг является спорадическим социальным взаимодействием, особенно по сравнению с антеннацией и трофаллаксисом (33), мы предсказали, что эффект от снижения антеннации и трофаллаксиса перевесит ожидаемое увеличение аллогруминга. Поэтому можно было бы ожидать снижения связности сети и центральности узла (степень, в которой пчела хорошо связана в сети социальных взаимодействий, учитывая как выполненные, так и полученные взаимодействия, т.е. исходящую и входящую центральность, соответственно) в зараженных группах на уровне всей сети и/или снижения индивидуальной центральности в зараженных группах (особенно у зараженных особей) на уровне отдельного узла (пчелы).
Наше исследование показывает, что колонии медоносных пчел реагируют на вторжение эктопаразитического клеща значительными изменениями в поведенческих признаках, связанных с социальным иммунитетом (использование пространства и социальные взаимодействия) как на уровне всей колонии, так и на уровне отдельных особей. Эти результаты убедительно свидетельствуют о том, что медоносные пчелы ограничивают распространение паразитов внутри колонии путем социального дистанцирования.

Результат

Эксперимент с целыми колониями

Предсказание 1

Чтобы проверить предсказание 1 (рис. 1), т.е. пространственное смещение кормовых танцев к периферии колонии под давлением паразитов, мы проверили, происходят ли кормовые танцы в основном на боковых рамках, а не на центральных (предсказание 1a) и/или ближе к входу в улей, а не на центральной части гребня (предсказание 1b), в зараженных варроа ульях по сравнению с ульями без варроа. Более того, поскольку колонизация расплодных ячеек является решающим шагом в размножении варроа, дальнейшее предсказание, которое мы проверили, заключалось в снижении кормовых танцев на расплодных ячейках в зараженных колониях по сравнению с незараженными колониями (предсказание 1c). Чтобы легче определить положение в гребне по отношению к входу в улей, где происходило поведение, наблюдаемая рамка была разделена на шесть частей равной площади, как показано на рис. S1.

Рис. 1. Краткое описание экспериментальной схемы.
Вызывает ли заражение клещами Варроа изменения в использовании пространства и социальном поведении у медоносной пчелы?

Средняя сила колонии была одинаковой в двух группах (количество взрослых пчел и запечатанных расплодных ячеек, без варроа: 22 581 ± 1761 против зараженных варроа: 21 793 ± 3168; среднее + SE; U-тест Манна-Уитни; U = 7, df = 4, P > 0. 05; таблица S1), тогда как уровень зараженности (средний процент клещей на взрослую пчелу ± SE) в зараженной варроа группе был значительно выше по сравнению с группой без варроа (6,18 ± 0,34% против 0,11 ± 0,11%, U-тест Манна-Уитни; U = 10, df = 4, P < 0,05; таблица S1). Ульи без варроа были получены путем обработки половины колоний прилитой щавелевой кислотой каждую неделю, в течение трех недель подряд, начиная с 2 месяцев до начала наблюдений. В группе, зараженной варроа, была проведена только первая обработка прилитой щавелевой кислотой за 2 месяца до начала наблюдений, после чего заражение варроа выросло естественным образом. Проверяя видеозаписи, сделанные в ульях двух экспериментальных групп, мы обнаружили в один и тот же промежуток времени (13 часов и 30 минут на группу) в общей сложности 394 и 453 случая кормовых танцев (круговых и виляющих) в колониях без варроа и в колониях, зараженных варроа, соответственно. Частота танцев не отличалась между двумя экспериментальными группами [обобщенная линейная смешанная модель (GLMM) с использованием дня, временного интервала записи и кода улья в качестве случайных факторов; χ2 = 0,254, df = 1, P = 0,613; рис. S2A], а также при рассмотрении двух типов танца (хоровод и виляние) (эффект взаимодействия между экспериментальной группой и типом танца; GLMM с использованием дня, временного интервала записи и кода улья в качестве случайных факторов; χ2 = 2,098, df = 1, P = 0,147; рис. S2B). Мы обнаружили сильную поддержку предсказания периферического сдвига в выражении кормовых танцев (рис. 2A). При сравнении двух типов рамок (центральной и боковой) мы обнаружили значительные различия в относительной частоте кормовых танцев (круговых и виляющих) в зараженных варроа колониях и между зараженными варроа и свободными от варроа колониями [эффект взаимодействия между экспериментальной группой и положением рамки; линейная смешанная модель (LMM) с использованием дня, временного интервала записи и кода улья в качестве случайных факторов; χ2 = 25,227, df = 1, P < 0,001]. В частности, подтверждая предсказание 1a, относительная частота танцев была значительно выше в боковой рамке и значительно ниже в центральной рамке в зараженной группе по сравнению с незараженной группой [LMM с использованием дня, временного интервала записи и кода улья в качестве случайных факторов, тест Tukey post hoc с поправкой на коэффициент ложных обнаружений (FDR), центральная рамка; z = 3,552, P < 0,001; боковая рамка; z = 3,550, P < 0,001; рис. 3]. Кроме того, рассматривая две экспериментальные группы независимо друг от друга, мы обнаружили более высокую относительную частоту кормовых танцев в боковой пищевой рамке, чем в центральной расплодной рамке в зараженной группе (LMM с использованием дня, временного интервала записи и кода улья в качестве случайных факторов, пост-хок тест Тьюки с коррекцией FDR; z = 5. 519, P < 0,001; рис. 3), тогда как в колониях без варроа существенных различий между этими двумя типами рамок не наблюдалось (LMM с использованием дня, временного интервала записи и кода улья в качестве случайных факторов, тест Tukey post hoc с коррекцией FDR; z = 1,584, P = 0,113; рис. 3). Кормовое танцевальное поведение также варьировалось в зависимости от положения гребня по отношению к входу в улей (уровень рамки; рис. S1), подтверждая предсказание 1b (эффект взаимодействия между экспериментальной группой и положением гребня; LMM с использованием дня, временного интервала записи и кода улья в качестве случайных факторов; χ2 = 29,941, df = 5, P < 0,001; рис. 4). В колониях, зараженных варроа, по сравнению с колониями без варроа, танцы наблюдались чаще в нижнем положении около входа (рис. S1) и реже в нижнем центральном положении (рис. S1) (LMM с использованием дня, временного интервала записи и кода улья в качестве случайных факторов, тест Тьюки с поправкой FDR; z = 4,201, P < 0,001; z = 3,020, P = 0,002; соответственно; рис. 4). Во всех других положениях гребня не было различий в относительной частоте кормовых танцев между колониями без варроа и зараженными варроа (LMM с использованием дня, временного интервала записи и кода улья в качестве случайных факторов, тест Tukey post hoc с коррекцией FDR; P > 0,05; рис. 4). Тип гребневого субстрата (уровень ячеек) также был сильным предиктором относительной частоты кормовых танцев, происходящих в колониях без Варроа и зараженных Варроа (эффект взаимодействия между экспериментальной группой и типом гребневого субстрата;

LMM с использованием дня, временного интервала записи и кода улья в качестве случайных факторов; χ2 = 23,001, df = 5, P < 0,001; рис. 5). В частности, подтверждая предсказание 1c, относительная частота кормовых танцев на закрытых расплодных ячейках была значительно ниже в зараженных варроа колониях по сравнению с колониями без варроа (LMM с использованием дня, временного интервала записи и кода улья в качестве случайных факторов, пост hoc тест Тьюки с коррекцией FDR; z = 3,219, P = 0,0012; рис. 5). Кроме того, в зараженных варроа колониях танцы на пыльце (не расплодных клетках) были гораздо чаще, чем в колониях без варроа (LMM с использованием дня, временного интервала записи и кода улья в качестве случайных факторов, тест Tukey post hoc с коррекцией FDR; z = 2,962, P = 0,003; рис. 5).

Рис. 2.
Индуцированный организационный иммунитет.
Пространственный сдвиг в кормовых танцах (A) и аллогруминговом поведении (B), наблюдаемый в эксперименте с целой колонией.

Рис. 3.
Пространственный сдвиг в кормовых танцах.
Относительная частота (среднее ± SE) танцев (круговых и виляющих) на улей и день наблюдения, обнаруженных в колониях без варроа и зараженных варроа в зависимости от типа рамки (центральная или боковая). Столбики с разными буквами значительно отличаются (P < 0,05).

Рис. 4.
Пространственный сдвиг в кормовых танцах.
Относительная частота (среднее ± SE) танцев (круговых и виляющих) на улей и день наблюдения, обнаруженных в колониях без варроа и зараженных варроа в зависимости от положения в рамке по отношению к входу в улей [нижнее и верхнее положение около входа (LE и UE), нижнее и верхнее центральное положение (LC и UC), нижнее и верхнее положение далеко от входа (LF и UF)]. Незначительно (ns), P > 0,05; **P < 0,01; и ***P < 0,001.

Рис. 5.
Пространственный сдвиг в кормовых танцах.
Относительная частота (среднее ± SE) танцев (круговых и виляющих) на улей и день наблюдения, обнаруженных в колониях без варроа и зараженных варроа в зависимости от типа субстрата [незакрытый и закрытый расплод (UB и CB); незакрытый и закрытый мед (UH и CH); пыльца (P); и смесь расплода, меда и пыльцы (BHP)]. ns, P > 0,05; и **P < 0,01.

Предсказание 2

Для проверки предсказания 2 (рис. 1), т.е. пространственного смещения поведения аллогруминга к ядру колонии под давлением паразитов, мы проверили, осуществлялся ли аллогруминг в основном на центральных рамках, а не на боковых (предсказание 2a), на центральной части гребня, а не около входа в улей (предсказание 2b; рис. S1) и/или на незакрытых расплодных ячейках, а не на пищевых ячейках (предсказание 2c; рис. S1) в зараженных варроа ульях по сравнению с ульями без варроа. В тех же видеозаписях, использованных для кормовых танцев (13 часов и 30 минут на группу), мы обнаружили в общей сложности 67 и 100 случаев аллогруминга в колониях без варроа и зараженных варроа, соответственно. Наблюдаемая частота аллогруминга не отличалась между двумя экспериментальными группами (свободные от варроа и зараженные варроа) (GLMM с использованием дня, временного интервала записи и кода улья в качестве случайных факторов; χ2 = 2,828, df = 1, P = 0,092; рис. S3). Среднее число грумеров на одно событие аллогруминга, равное примерно 1, также существенно не отличалось между двумя группами (GLMM с использованием дня, временного интервала записи и кода улья в качестве случайных факторов; χ2 = 0,592, df = 1, P = 0,597).
Мы обнаружили сильную поддержку нашего предсказания 2 (рис. 2B). Хотя относительная частота наблюдаемых событий аллогруминга существенно не отличалась между колониями без варроа и зараженными варроа при сравнении двух типов рамок [эффект взаимодействия между экспериментальной группой (зараженная варроа и без варроа) и типом рамок; LMM с использованием дня, временного интервала записи и кода улья в качестве случайных факторов; χ2 = 1,407, df = 1, P > 0,05; рис. 6], мы обнаружили значительно более высокую частоту событий аллогруминга. 6], мы обнаружили значительно более высокую относительную частоту событий аллогруминга в центральной рамке по сравнению с боковыми в зараженных колониях (предсказание 2a; LMM с использованием дня, временного интервала записи и кода улья в качестве случайных факторов, Tukey post hoc test с коррекцией FDR; z = 2. 536, P = 0,011; рис. 6) и никаких различий между центральными и боковыми рамками в незараженной группе (LMM с использованием дня, временного интервала записи и кода улья в качестве случайных факторов, тест Tukey post hoc с коррекцией FDR; z = 0,858, P = 0,390; рис. 3A). Смещение аллогруминга в сторону ядра колонии в зараженных колониях было также подтверждено пространственным анализом на уровне гребней (предсказание 2b). В каждой экспериментальной группе аллогруминг значительно различался в зависимости от положения гребня относительно входа в улей (LMM с использованием дня, временного интервала записи и кода улья в качестве случайных факторов; χ2 = 18,813, df = 5, P = 0,002; рис. 7). При сравнении колоний без варроа и зараженных варроа, относительная частота аллогруминга была значительно выше в верхнем центральном положении колоний, зараженных варроа (LMM с использованием дня, временного интервала записи и кода улья в качестве случайных факторов, тест Tukey post hoc с коррекцией FDR; z = 7,417, P = 0,016; рис. 4B). Для всех других положений гребня не было обнаружено различий в относительной частоте событий аллогруминга между двумя экспериментальными группами (LMM с использованием дня, временного интервала записи и кода улья в качестве случайных факторов, Tukey post hoc test с коррекцией FDR; P > 0,05; рис. 7). Наконец, подтверждая предсказание 2c, мы наблюдали более высокую относительную частоту аллогруминга на незакрытых расплодных ячейках в зараженных колониях, чем в незараженных (LMM с использованием дня, временного интервала записи и кода улья в качестве случайных факторов, тест Tukey post hoc с коррекцией FDR; z = 2,345, P = 0,019; рис. 8). Во всех других типах субстрата (мед, пыльца и смесь меда и пыльцы) мы не обнаружили существенных различий между колониями без варроа и зараженными варроа (LMM с использованием дня, временного интервала записи и кода улья в качестве случайных факторов, тест Tukey post hoc с коррекцией FDR; P > 0,05; рис. 8).

Рис. 6.
Пространственный сдвиг в поведении аллогруминга.
Относительная частота (среднее ± SE) случаев аллогруминга на улей и день наблюдения, обнаруженных внутри гнезда в колониях без варроа и зараженных варроа в зависимости от типа рамки (центральная или боковая). Столбики с разными буквами значительно отличаются (P < 0,05).

Рис. 7.
Пространственный сдвиг в поведении аллогруминга.
Относительная частота (среднее ± SE) случаев аллогруминга на улей и день наблюдения, обнаруженных внутри гнезда в колониях без варроа и зараженных варроа в зависимости от положения в рамке по отношению к входу в улей [нижнее и верхнее положение около входа (LE и UE), нижнее и верхнее центральное положение (LC и UC), нижнее и верхнее положение далеко от входа (LF и UF)]. ns, P > 0,05; и *P < 0,05.

Рис. 8.
Пространственный сдвиг в поведении аллогруминга.
Относительная частота (среднее ± SE) случаев аллогруминга на улей и день наблюдения, обнаруженных внутри гнезда в колониях без варроа и зараженных варроа в зависимости от типа субстрата [незакрытый и закрытый расплод (UB и CB); незакрытый и закрытый мед (UH и CH); пыльца (P); и смесь расплода, меда и пыльцы (BHP)]. ns, P > 0,05; и *P < 0,05.

Наблюдение с высоким разрешением за индивидуальным социальным поведением

Предсказание 3

Для проверки предсказания 3 (рис. 1), т.е, увеличение индивидуального социального поведения, которое обычно ограничивает распространение болезни, например, аллогруминг (предсказание 3a), и уменьшение тех, которые увеличивают вероятность распространения, например, антеннация (предсказание 3b) и трофаллаксис (предсказание 3c), Мы провели эксперимент по сравнению индивидуальной частоты каждого типа поведения между взрослыми пчелами из группы без варроа, непаразитированными (V0), и пчелами из группы, зараженной варроа, которая включала паразитированных (V+) и непаразитированных (V-) взрослых пчел в равной пропорции (процент заражения 50%). Эксперимент на индивидуальном уровне был повторен три раза, используя шесть независимых клеток (три для зараженной группы и три для незараженной группы), каждая из которых содержала 12 помеченных пчел в каждом повторе.
Проверяя видеозаписи, записанные на клетках групп, свободных от варроа и зараженных варроа (180 мин видеозаписи на группу), мы обнаружили следующее: (i) 160 и 183 события аллогруминга, соответственно; (ii) 1198 и 1015 событий антеннации, соответственно; и (iii) 889 и 654 события трофаллаксиса, соответственно.
Когда мы рассматривали индивидуальные действия пчел (выборка фокальных животных), различия в средней частоте аллогруминга между исполнителями (дающими) двух групп в клетках не были значительными [GLMM с использованием клетки и эксперимента (реплики) в качестве случайных факторов; χ2 = 2,217, df = 1, P = 0,136; рис. 9A]. В то же время, когда учитывались приемники, предсказание 3a подтвердилось, и были получены значительные различия в средней частоте аллогруминга между группами без варроа и зараженными варроа [GLMM с использованием клетки и эксперимента (повтор) в качестве случайных факторов; χ2 = 4,150; df = 1, P = 0,04; рис. 9A]. Средняя частота аллогруминга, который получала особь, была выше у паразитировавших взрослых пчел из зараженной варроа группы (V+) по сравнению с непаразитировавшими взрослыми пчелами из группы без варроа (V0) [GLMM с использованием клетки и эксперимента (повтор) в качестве случайных факторов, пост hoc тест Тьюки с коррекцией FDR; z = 2,393, P = 0,016; рис. 9].

Рис. 9. Частота аллогруминга, антенации и трофаллаксиса.
Индивидуальная частота аллогруминга (A), антенации (B) и трофаллаксиса (C), совершенных и полученных в клетках, свободных от варроа и зараженных варроа (квадратные диаграммы показывают медиану и интерквартильный размах). V0 — непаразитированные особи из группы без варроа, V- и V+ — непаразитированные и паразитированные особи из группы, зараженной варроа, соответственно. *P < 0,05 и **P < 0,01.

Предсказание 3b, т.е. снижение частоты антеннации — поведения, которое увеличивает вероятность распространения паразитов, в зараженных колониях, не подтвердилось нашими наблюдениями. Напротив, было отмечено общее увеличение частоты антенации в зараженных группах по сравнению с незараженными [GLMM с использованием клетки и эксперимента (реплики) в качестве случайных факторов; χ2 = 4,917, df = 1, P = 0,026]. Это произошло потому, что паразитирующие особи (V+) в клетках, зараженных варроа, получили больше антенн по сравнению с непаразитирующими особями из клеток без варроа (V0) и из той же группы (V-) [GLMM с использованием клетки и эксперимента (повтор) в качестве случайных факторов, тест Tukey post hoc с коррекцией FDR; z = 1,968, P = 0,045; z = 2,587, P = 0,009, соответственно; рис. 9B]. Более того, средняя частота выполненных или полученных антенн не отличалась между непаразитированными особями из зараженных варроа клеток (V-) и непаразитированными особями из свободных от варроа клеток (V0) [GLMM с использованием клетки и эксперимента (реплики) в качестве случайных факторов, тест Тьюки с поправкой FDR; z = 1,297, P = 0,194; рис. 9B]. В группе, зараженной варроа, мы отметили, что паразитировавшие особи (V+) выполняли меньше антенных движений по сравнению с непаразитировавшими (V-) [GLMM с использованием клетки и эксперимента (репликата) в качестве случайных факторов, тест Tukey post hoc с коррекцией FDR; z = 2,544, P = 0,011; рис. 9B].
Предсказание 3c, т.е. снижение трофаллаксиса, другого типа поведения, увеличивающего вероятность распространения паразитов, в зараженных колониях (рис. 1), также не подтвердилось нашими наблюдениями. Мы не обнаружили существенных различий в средней частоте выполненных или полученных трофаллаксисов между клетками без варроа и клетками, зараженными варроа [GLMM с использованием клетки и эксперимента (реплики) в качестве случайных факторов; χ2 = 2,622, df = 1, P > 0,05]. Кроме того, в группе, зараженной варроа, мы снова наблюдали значительно отличающуюся поведенческую модель между паразитированными и непаразитированными особями, в которой паразитированные особи (V+) получали больше трофаллаксиса, чем непаразитированные (V-) [GLMM с использованием клетки и эксперимента (повтор) в качестве случайных факторов, пост-хок тест Тьюки с коррекцией FDR; z = 2,763, P = 0,005; рис. 9C].

Предсказание 4

Чтобы проверить предсказание 4 относительно изменений в структуре социальных сетей в зараженных группах (рис. 1), мы проверили, происходит ли под давлением паразита снижение связности сети и центральности узлов на уровне всей сети (предсказание 4a) и/или снижение центральности индивидуума на уровне одного узла (пчелы) (предсказание 4b). Социальные сети групп, свободных от варроа и зараженных варроа, состояли из одного компонента и были в целом тесно связаны. Мы не нашли подтверждения предсказанию 4a, поскольку не было никакой разницы в индексе связности сети между группами без варроа и зараженными варроа (предсказание 4a; LMM с использованием клетки, эксперимента и колонии происхождения в качестве случайных факторов; χ2 = 0,075, df = 1, P = 0,783; рис. S4). Мы также не нашли подтверждения предсказанию 4b. Положение особей в социальной сети не различалось среди непаразитировавших особей группы без варроа (V0) и непаразитировавших (V-) и паразитировавших (V+) особей группы, зараженной варроа, по большинству измеренных показателей центральности: исходящая центральность (LMM с использованием клетки, эксперимента и колонии происхождения в качестве случайных факторов, тест Tukey post hoc с коррекцией FDR; P > 0. 05; рис. 10A), между (LMM с использованием клетки, эксперимента и колонии происхождения в качестве случайных факторов, Tukey post hoc test с коррекцией FDR; P > 0.05; рис. 10B) и коэффициент кластеризации (LMM с использованием клетки, эксперимента и колонии происхождения в качестве случайных факторов, Tukey post hoc test с коррекцией FDR; P > 0.05; рис. 10C). Только входящая центральность различалась между группами, но в направлении, противоположном предсказанному, будучи выше в V+, чем в V-группе (LMM с использованием клетки, эксперимента и колонии происхождения в качестве случайных факторов, тест Tukey post hoc с коррекцией FDR; z = 2,487; P = 0,03, рис. 10D).

Рис. 10.
Параметры социальной сети.
Сравнение показателей центральности, т.е. исходящей центральности (A), промежуточности (B), коэффициента кластеризации (C) и входящей центральности (D), среди непаразитированных (V0) особей в группах без варроа и непаразитированных (V-) и паразитированных (V+) особей в группах, зараженных варроа. На коробчатых графиках представлены медиана (линия), квартили (коробка) и крайние значения (не более чем в 1,5 раза больше интерквартильного размаха, усы). *P < 0.05.

Дискуссия

Паразитические клещи представляют собой проблему для нескольких сообществ насекомых, а заражение V. destructor является одной из самых серьезных угроз для медоносной пчелы A. mellifera. Появление и распространение клеща вызывает ряд заметных поведенческих изменений в колониях медоносных пчел. Например, было показано, что этот паразит влияет на активность выращивания расплода (23), ускоряет временной полиэтизм, что приводит к ранней кормовой активности (37), и снижает способность к ориентации у фуражиров, усиливая тем самым явление дрейфа (38, 39). Насколько нам известно, здесь мы приводим доказательства того, что V. destructor значительно влияет на использование пространства и социальные взаимодействия внутри улья, причем зараженные колонии демонстрируют изменения в признаках, связанных с социальным иммунитетом (использование пространства и социальные взаимодействия) на уровне всей колонии и отдельных особей.
При заражении паразитом или патогеном колония может выиграть от принятия индуцированного организационного иммунитета, т.е. ограничить распространение патогена за счет увеличения пространственной и поведенческой компартментализации различных когорт особей (8, 9). Мы обнаружили две линии доказательств, подтверждающих это, когда наблюдали за двумя видами поведения, вероятно, участвующими в распространении паразита, а именно, за кормовыми танцами и аллогрумингом, в зараженных и незараженных колониях. Во-первых, мы обнаружили, что кормовые танцы, которые могут способствовать проникновению Varroa в колонию через автостоп на теле фуражиров (25, 26), чаще происходили на периферии улья в зараженных колониях по сравнению с незараженными колониями. В последних фуражиры танцевали как в центральных, так и в боковых рамках, в соответствии с предыдущими результатами (29). Если рассматривать положение внутри гребня (уровень рамки), то преобладание фуражиров, танцующих в нижней половине гребня в обеих группах, вероятно, связано с тем, что эта область более освещена, как было отмечено в других исследованиях (29, 40, 41). Однако в зараженных колониях кормовые танцы были сконцентрированы ближе ко входу в улей, в то время как в незараженной группе кормовые танцы были распределены одинаково в положении ближе ко входу в улей и в центральной части гребня. На уровне ячеек (тип субстрата) в зараженной группе наблюдалось относительное увеличение частоты танцев, исполняемых на пищевых ячейках, в ущерб танцам, исполняемым на закрытых расплодных ячейках, тогда как в незакрытых расплодных ячейках изменений не произошло. Этот результат кажется частично противоречащим нашему прогнозу, учитывая, что незакрытый расплод представляет собой субстрат, используемый варроа для размножения. Однако, согласно Таутцу (42) и Таутцу и Рорсейцу (43), когда танец исполняется на открытых клетках, таких как незакрытые выводковые клетки, колебательный сигнал передается на большее расстояние и более эффективно, что приводит к большему привлечению других фуражиров. Таким образом, наши результаты свидетельствуют о компромиссе между необходимостью ограничить распространение паразита и необходимостью поддерживать эффективную коммуникацию внутри колонии в зараженных ульях. Изменение в использовании пространства, которое мы наблюдали в присутствии варроа, может быть интерпретировано как стратегия смягчения последствий паразитоза (индуцированный организационный иммунитет), поскольку смещение кормовых танцев на периферию уменьшает контакт между периферией (фуражиры) и ядром (медсестры) колонии (8, 9). В то же время, эффективная коммуникация внутри колоний зараженной группы поддерживается путем выполнения кормовых танцев на незакрытом расплоде так же часто, как и в незараженной группе.
Вторая линия доказательств представлена различиями в пространственном паттерне аллогруминга, обнаруженными между зараженными и незараженными колониями. Мы обнаружили, что аллогруминг, который может уменьшить распространение и частоту паразитизма (32), чаще происходил на центральных рамках, чем на боковых, в центральных областях гребня, обычно занятых расплодом, и на незакрытом расплоде в зараженных ульях по сравнению с незараженными. Ожидается, что в зараженных колониях аллогруминг будет сосредоточен в ядре колонии, т.е. в области гребня с расплодом, где остаются медсестры и где могут чаще появляться новоявленные пчелы, несущие клещей (17, 19).

Два не взаимоисключающих процесса могут объяснить пространственный сдвиг в аллогруминге, наблюдаемый в зараженных колониях. Во-первых, аллогруминг может осуществляться там, где клещи наиболее вероятны, в соответствии с теорией организационного иммунитета. Клещи предпочтительно паразитируют на пчелах-кормилицах, чтобы улучшить свою приспособленность (27) и быть перенесенными вблизи расплодных ячеек, в которые они должны проникнуть для размножения (17, 19). Кроме того, смещение аллогрумеров к центру гнезда в зараженных колониях может быть индикатором смещения всей когорты молодых рабочих к центру гнезда, чтобы увеличить расстояние между ними и когортой старших пчел (фуражиров), которые обычно занимают внешнюю часть гнезда.
На основании наших результатов, связанных с кормовыми танцами и аллогрумингом, мы предположили, что колонии медоносных пчел реагируют на присутствие варроа перемещением кормилиц к периферии гнезда, а молодых пчел (медсестер) — к его центру, увеличивая таким образом расстояние между этими двумя когортами пчел по сравнению с тем, которое обнаруживается в отсутствие паразитизма.
Анализ на уровне всей колонии предоставил сильные доказательства индуцированного организационного иммунитета, в то время как результаты на индивидуальном уровне, полученные на особях когорты (1-дневные пчелы) в экспериментах в клетках, предоставили неоднозначную поддержку. С одной стороны, повышенный уровень аллогруминга, полученный зараженными варроа 1-дневными пчелами, подтвердил предсказания теории социального иммунитета. С другой стороны, наблюдаемое увеличение антеннации и трофаллаксиса в зараженных группах по сравнению с незараженными группами не подтвердило наши предсказания. Увеличение антеннации, получаемой зараженными особями, вероятно, связано с обнаружением сигналов, испускаемых паразитом (35, 44), а их большая склонность к получению большего количества трофаллаксиса, чем у незараженных особей той же группы, может быть способом ограничения агрессивного поведения сородичей и увеличения признания со стороны других пчел (13). Эти результаты противоречат предсказанию о снижении уровня взаимодействия для уменьшения распространения клеща. Более того, анализ структуры сети показал отсутствие значительной стратегии организационного иммунитета, вызванной присутствием клеща, так как мы не нашли никаких доказательств снижения социальной сплоченности в пределах одной и той же группы особей (уровень всей сети) или снижения центральности зараженных пчел по сравнению с другими пчелами в социальной сети. Напротив, зараженные пчелы были даже более центральными, чем незараженные, вероятно, из-за более высоких уровней аллогруминга, антеннации и трофаллаксиса. Такое отсутствие социальной дистанцированности при еще более высокой связности зараженных особей противоречит предсказаниям организационного иммунитета, тогда как увеличение заботы может быть разумным объяснением с точки зрения социального иммунитета, поскольку такое поведение может помочь снизить нагрузку паразитов (32). Однако следует учитывать, что поведение по уходу, которое требует физического контакта, может иметь противоположные эффекты: Оно может снизить уровень инфекции, убивая часть клещей, атакующих зараженных пчел, но также может способствовать ее распространению среди ухаживающих (45). Наши общие результаты показывают, что социальное дистанцирование происходит в больших масштабах (т.е. на уровне колонии), но не в меньших масштабах (внутри когорты пчел), где, по-видимому, преобладает поведение заботы. Это позволяет предположить, что компромисс между защитой и риском передачи инфекции в результате социальных взаимодействий может варьироваться в зависимости от пространственного масштаба и рассматриваемой когорты. Хотя мы признаем, что отсутствие доказательств не является доказательством их отсутствия, можно предположить, что в группах, расположенных в ядре колониальной социальной сети (например, в наших экспериментальных группах из 12 недавно появившихся пчел), эргономическая оптимизация может превалировать над необходимостью уменьшить распространение болезни. В ядре общества избыточная компартментализация, позволяющая избегать взаимодействия с зараженными сородичами, может привести к социальной дезорганизации и резкой потере рабочей силы. Хотя наше исследование не дает доказательств в поддержку ни одной из двух гипотез (уход или эргономическая оптимизация), оно показывает важность изучения вариаций стратегий социального иммунитета и их взаимодействия на разных уровнях (например, возраст когорты) и контекстах в сообществах насекомых (46-48).

Наше исследование ясно показывает, что колонии медоносных пчел реагируют на эктопаразита V. destructor, изменяя использование пространства, таким образом увеличивая социальную дистанцию между когортой молодых и старых пчел. Эти результаты согласуются с теорией индуцированного организационного иммунитета, описанной Строймейтом и др. (9) у L. niger, зараженного грибковым патогеном M. brunneum, и Геффре и др. (13) у медоносных пчел, зараженных израильским вирусом острого паралича. У медоносных пчел эта динамика наблюдается и на более высоких уровнях биологической организации. Было установлено, что горизонтальная передача V. destructor значительно увеличивается по мере уменьшения межколониального расстояния (49, 50). Поэтому можно предположить, что большие расстояния, наблюдаемые между колониями пчел в естественных условиях (51), которые намного больше тех, что используются в современном пчеловодстве, являются результатом эволюционного пути, вызванного, по крайней мере частично, необходимостью ограничить межколониальное распространение болезней и гарантировать более рациональную эксплуатацию пищевых ресурсов.
Социальное дистанцирование как поведенческая реакция на болезнь, конечно, дорого обходится всем социальным животным, как это переживает и человечество во время нынешней пандемии COVID-19 (коронавирусная болезнь 2019) (52, 53), но широкое использование этой стратегии в природе предполагает, что выгоды могут перевешивать затраты (54, 55). Продемонстрированная социальными насекомыми способность модулировать свою социальную структуру в зависимости от риска передачи заболеваний позволяет особям по возможности максимизировать выгоды от социальных взаимодействий и минимизировать специфический риск инфекционных заболеваний (54, 55). Кроме того, для минимизации социальных издержек можно предпочесть специфические изменения в социальной структуре (например, в пространстве, частотах и свойствах сети) при сохранении взаимодействия внутри группы (54).

В заключение, наши данные о социальном иммунитете у A. mellifera свидетельствуют о том, что клещ V. destructor вызывает поведенческие и пространственные изменения у медоносных пчел в ответ на распространение инвазии. Такая поведенческая пластичность, вероятно, помогает найти баланс между обменом информацией, который необходим социальным животным, таким как медоносные пчелы, и борьбой с распространением болезней и паразитов в улье.

Материалы и методы

Экспериментальная пасека

Исследование проводилось на пасеке экспериментальной фермы факультета сельскохозяйственных наук Университета Сассари, расположенной в Оттаве на северо-западе острова Сардиния (40°46′23″N, 8°29′34″E) (Италия), с мая 2019 года по ноябрь 2019 года. Пасека состояла из 18 колоний A. mellifera ligustica: 6 колоний содержались в наблюдательных ульях (которые имели два стеклянных окна, одно справа и одно слева) для проведения исследований внутри гнезда, а 12 колоний содержались в стандартных ульях Даданта-Блатта в качестве источника рабочих пчел и клещей для лабораторных экспериментов. Ульи Даданта-Блатта и наблюдательные ульи содержали по 10 сотов и имели вход в гнездо с рисунком другого цвета для уменьшения дрейфа (56). В течение экспериментального периода за каждой колонией наблюдали каждые 15 дней, чтобы оценить наличие королевы, расплода и корма. Перед каждым экспериментом уровень зараженности колонии контролировался в соответствии со стандартной процедурой (57). Кроме того, сила колонии оценивалась путем определения общего запечатанного расплода и количества взрослых пчел в улье (58). Для этого в качестве единицы измерения использовали одну шестую часть рамки Даданта-Блатта (1880 мм2), а количество запечатанных ячеек и взрослых пчел получали путем умножения количества шестых частей каждой матрицы на 780 и 254, соответственно (58). Девять ульев без варроа были получены путем обработки половины колоний пасеки прилитой щавелевой кислотой каждую неделю, в течение трех недель подряд, начиная с 2 месяцев до начала наблюдений. В остальных девяти колониях была проведена только первая обработка прилитой щавелевой кислотой за 2 месяца до начала наблюдений, после чего уровень заражения варроа вырос естественным образом. Сила колоний была сбалансирована в обеих экспериментальных группах путем удаления расплодных рамок из самых сильных колоний.

Наблюдения за поведением целой колонии

Наблюдения за кормовыми танцами и аллогрумингом проводились в соответствии с «методом выборки по всем случаям» (59). Видеозаписи проводились одновременно в группах без варроа (три колонии, средний ± SE, уровень заражения 0,11 ± 0,11%) и зараженных варроа (три колонии, средний ± SE, уровень заражения 6,2 ± 0,34%) с помощью четырех камер высокой четкости (HD) (Canon LEGRIA HF R506, Токио, Япония), по две на каждый из двух сравниваемых ульев одновременно (60). В течение трех последовательных дней каждую колонию записывали в течение 15 минут три раза в день (утром, днем и вечером) между 10:30 и 18:30, размещая две видеокамеры на расстоянии ~30 см от каждого стеклянного окна (с правой и левой стороны). В общей сложности было отснято 27 часов видеозаписи в случайном порядке среди шести ульев, каждый из которых наблюдался в течение одинаковой продолжительности (4,5 часа). Наблюдения проводились одновременно на двух типах гребенок, отобранных за 12 часов до начала эксперимента: Один был взят из центральной части гнезда и представлял запечатанный и незапечатанный расплод по крайней мере на 60% его поверхности (центральная рамка), в то время как второй был взят с боковых сторон улья и имел незапечатанный и запечатанный мед и пыльцу по крайней мере на 60% его поверхности (боковая рамка). На поверхности обоих сотов были представлены все типы субстратов: запечатанный и незапечатанный расплод, запечатанный и незапечатанный мед и пыльца. За час до начала видеосъемки два выбранных сота помещались непосредственно за стеклянными окнами каждого улья. Перемещение центральных сотов в боковое положение на время, необходимое для видеосъемки, не меняет их статуса «центральных сотов», так как фуражиры отмечают положение сотов, где они исполняют танцы после первых фуражировочных полетов, и затем возвращаются на те же позиции для повторения их в течение остальной части дня (29, 41, 42). Два типа сотов наблюдались поочередно с правой и левой стороны улья, чтобы избежать эффекта положения. Впоследствии видеозаписи были просмотрены с помощью программы BORIS версии 7.9.15 (61) для определения частоты (т.е. количества событий в единицу времени) кормовых танцев и аллогруминга. Последние учитывались только в том случае, если они происходили в течение не менее 2 с. Чтобы легче определить положение гребня по отношению ко входу в улей, где происходили наблюдаемые типы поведения, операторы разделили каждый кадр наблюдения на шесть частей равной площади, как показано на рис. S1. Также регистрировались типы субстрата, на котором происходили кормовые танцы и аллогруминг: расплод без крышечек и с крышечками, мед без крышечек и с крышечками, пыльца и смесь расплода, меда и пыльцы. При просмотре видеозаписей оператор не знал о степени зараженности улья (слепой экспериментальный план).

Наблюдение с высоким разрешением за индивидуальным социальным поведением

Источник медоносных пчел и клещей

Медоносные пчелы и клещи V. destructor, использованные в биопробах социальных сетей, были взяты из ульев Даданта-Блатта нашей экспериментальной пасеки. Зараженные колонии использовались как источник клещей Варроа, а незараженные (уровень заражения < 1%) — как источник расплода медоносных пчел. Чтобы получить новых пчел для наших экспериментов, готовый к выходу расплод медоносных пчел был собран из трех колоний, свободных от варроа, и содержался в инкубаторе при контролируемых условиях окружающей среды (35°C, относительная влажность 70%, темнота) в течение 20 часов (62). Всех появившихся пчел кормили раствором сахарозы 50% (w/v) в течение 2 часов перед началом экспериментов, чтобы избежать того, что дифференцированный рацион может повлиять на социальные сети, как отмечали Науг и Смит (6) и Науг (7). Взрослых самок клещей отбирали из расплодных ячеек колоний, зараженных варроа, в тот же день, когда ставился каждый биопроба. Медоносные пчелы или клещи, которые демонстрировали аномальную подвижность, размер или цвет, не включались в эксперименты.
Поведенческая биопроба
Не зараженные новые пчелы, происходящие из трех неродственных колоний, свободных от варроа, были помечены с помощью набора для маркировки маток, состоящего из цветных пронумерованных бирок (2 мм Ø), нетоксичного клея типа смолы и палочки. Бирка, цвет которой (белый, розовый и желтый) соответствовал колонии происхождения пчелы, а конкретный номер — каждой отдельной пчеле, приклеивалась к грудной клетке каждой пчелы (код пчелы). Чтобы получить незараженных или зараженных пчел, каждую помеченную пчелу переносили в индивидуальную чашку Петри с клещом Варроа или без него и выдерживали там в течение 2 часов. В биопробах использовались только те зараженные пчелы, на которых паразит был визуально различим (V+) и предпочтительно введен между брюшными сегментами. В каждом биопробе были сформированы следующие экспериментальные группы пчел (обработки): группы без варроа (V0), без паразитирующих пчел, и группы, зараженные варроа, с 50% паразитирующих пчел. Каждая обработка состояла из трех независимых металлических клеток с 12 пчелами в каждой (12 пчел × 3 повторности = 36 пчел на обработку на эссе). Чтобы предотвратить любой генотипический эффект, каждая группа из 12 пчел состояла из четырех пчел, происходящих из каждой из трех колоний. Чтобы получить 50% уровень заражения в группе, зараженной варроа, шесть зараженных пчел (V+) (две пчелы на колонию) и шесть незараженных пчел (V-) (две пчелы на колонию) были помещены в каждую клетку этой обработки. Каждая биопроба была повторена три раза, в общей сложности 108 пчел на обработку. Каждая металлическая клетка (10 см на 10 см на 5 см) была покрыта листом пчелиного воска (9 см на 9 см) с самой большой внутренней стороны и закрыта стеклянным окном (10 см на 10 см). Код пчелы (цвет бирки и конкретный номер) каждой пчелы давал следующую информацию: колония происхождения, экспериментальная группа и, в группе, зараженной варроа, пчела с клещом или без клеща.

Наблюдения за поведением в клетках

Поведение каждой группы отслеживалось с помощью двух HD камер (Canon LEGRIA HF R506, Токио, Япония) (по одной камере на клетку), в течение 20 минут на клетку. Видеосъемка проводилась одновременно в одной клетке каждой экспериментальной группы (свободной от варроа или зараженной варроа). Частота следующих типов социального поведения регистрировалась с помощью «выборки фокальных животных», т.е. для каждой отдельной пчелы, присутствующей в садках (59): антеннация, трофаллаксис и аллогруминг. Для реконструкции социальной сети между особями в одной и той же экспериментальной группе (без варроа или зараженной варроа) и для сравнения структуры социальной сети в зависимости от воздействия паразита, были определены актор и реципиент каждого наблюдаемого социального взаимодействия, для всех типов социального взаимодействия (поведения). Во время поведенческих наблюдений также отмечалась передача паразитов от одной особи к другой. Кроме того, наличие или отсутствие варроа на каждой пчеле перепроверялось до и после фокального отбора проб в течение 20 мин. Все видеозаписи просматривались в замедленном режиме с использованием VLC Media Player версии 3.0.11.

Статистический анализ

Наблюдения за поведением всей колонии, прогнозы 1 и 2

Для проверки различий в частоте кормовых танцев и аллогруминга между ульями, свободными от варроа и зараженными варроа, мы использовали GLMM с отрицательной биномиальной структурой ошибок, используя день, временной интервал записи и код улья в качестве случайных факторов. Частота кормовых танцев и аллогруминг использовались как переменные отклика, а экспериментальная группа (свободные от варроа и зараженные варроа) — как фиксированный фактор. Для модели кормового танца, помимо экспериментальной группы, в качестве фиксированных факторов использовались тип танца (круговой и виляющий) и взаимодействие между экспериментальной группой и типом танца. Кроме того, чтобы проверить, различаются ли ульи без варроа и зараженные варроа в предпочтении исполнения кормовых танцев и аллогруминга в зависимости от положения рамки (центральное или боковое), положения относительно входа в улей и типа субстрата, мы использовали LMM, с днем, временным интервалом записи и кодом улья в качестве случайных факторов. Относительная частота кормовых танцев и аллогруминга [т.е. частота событий определенного поведения в зависимости от положения рамки, положения в гребне или типа субстрата, деленная на общую частоту всех событий, наблюдаемых для того же поведения в экспериментальной группе (зараженной или незараженной), умноженная на 100] использовалась в качестве переменных отклика, а экспериментальная группа (без варроа и зараженная варроа), пространственное положение и их взаимодействие использовались в качестве фиксированных факторов. Кроме того, для изучения различий в пространственном положении, в котором пчелы исполняли кормовые танцы и аллогруминговое поведение в ульях, свободных от варроа и зараженных варроа, использовали пост-хок тесты Тьюки с поправкой на множественные сравнения с помощью FDR. Кроме того, мы использовали GLMM с отрицательной биномиальной структурой ошибок для сравнения количества грумеров (исполнителей и получателей) между группой без варроа и зараженной варроа группой, используя день, временной интервал и код улья в качестве случайных факторов. Число грумеров использовалось в качестве переменной отклика, а экспериментальная группа (свободная от варроа и зараженная варроа) — в качестве фиксированного фактора.

Наблюдение с высоким разрешением индивидуального социального поведения, предсказания 3 и 4

Мы использовали GLMM с отрицательной биномиальной структурой ошибок, с клеткой и экспериментом (репликой) в качестве случайных факторов для следующих целей: (i) проверка различий в аллогруминге, антеннировании и трофаллаксисе между особями в клетках без варроа и зараженных варроа. Частота аллогруминга, антеннации и трофаллаксиса использовалась как переменные отклика, а экспериментальная группа (свободная от варроа и зараженная варроа) — как фиксированный фактор; и (ii) проверка различий в аллогруминге, антеннации и трофаллаксисе между особями из группы без варроа и особями с клещами на теле или без них из группы, зараженной варроа. Частота аллогруминга, антеннации и трофаллаксиса использовалась в качестве переменных отклика, а категория особей [особи из группы без варроа (V0) и особи с клещами (V+) или без клещей (V-) на теле из группы, зараженной варроа] использовалась как фиксированный фактор. Кроме того, для изучения различий в аллогруминге, антеннации и трофаллаксисе между особями V0, V+ и V- использовали пост-хок тесты Тьюки с поправкой на множественные сравнения с помощью FDR. Мы использовали отдельные модели для исполнителей и приемников. Все анализы смешанных моделей проводились с использованием пакета R lme4 (63).
Все допущения моделей GLMM и LMM проверялись визуально с помощью графиков остатков (т.е. плотность остатков, график квантиль-квантиль и подогнанные значения в сравнении со стандартизованными остатками), построенных с помощью функции mcp.fnc в пакете R LMERConvenienceFunctions (64) и графиков расстояний Кука, построенных с помощью пакета R influence. ME (65). Предположения модели были выполнены (остатки нормально распределены, однородность дисперсии и отсутствие выбросов). Пост-хок тесты Тьюки с поправкой на множественные сравнения по методу Бенджамина-Хохберга, для контроля FDR, проводились с использованием пакета R multcomp (66). Все анализы проводились с использованием R версии 4.0.2 (67).
Чтобы проверить, вызывает ли заражение варроа изменения в социальной сети пчел, мы сравнили незараженные (свободные от варроа) и зараженные (зараженные варроа) группы пчел на двух уровнях: (i) сплоченность общей социальной сети и (ii) индивидуальное положение каждой пчелы в ее социальной сети. Для каждой группы (N = 18) мы построили модель направленной и взвешенной сети, в которой узлы представляли отдельных пчел, а связи между узлами представляли социальные взаимодействия между любыми двумя данными узлами. Направление связи шло от актора к получателю поведения; например, при трофаллаксисе она шла от донора к получателю капли пищи. Вес каждой связи представлял собой сумму количества взаимодействий, происходящих между двумя данными узлами. Поскольку нас интересовала общая сеть социальных взаимодействий и учитывая, что некоторые виды поведения были недостаточно частыми для расчета сети (например, аллогруминг), некоторые виды поведения были сильно положительно коррелированы (антеннация и трофаллаксис; r Пирсона = 0,913, P < 0,001), и проводился индивидуальный анализ каждого отдельного вида поведения (см. выше), мы объединили антеннацию, трофаллаксис и аллогруминг для каждой пары узлов. Существует несколько показателей, оценивающих общую сплоченность данной сети. Чтобы получить полную характеристику структуры и связности сети, мы вычислили следующие показатели: (i) плотность сети, определяемая как общее количество всех значений связей, деленное на количество возможных связей; (ii) взвешенный коэффициент кластеризации, мера степени, в которой узлы в графе имеют тенденцию к кластеризации вместе, рассчитываемая как средневзвешенное значение коэффициента кластеризации всех участников, каждый из которых взвешен по своей степени; (iii) средневзвешенная степень, рассчитываемая как среднее значение суммы весов ребер вершин; (iv) индекс K-ядра, мера устойчивости сообщества в условиях вырождения, представленная максимальным подграфом, в котором каждая вершина имеет по крайней мере степень k; и (v) индекс Винера, т.е. e., сумма всех кратчайших путей между данной вершиной и всеми другими родственными вершинами в графе. Кроме того, на уровне диад (мотивов подсетей) мы вычислили транзитивность триплетов и взаимность дуг. Первый показатель — это количество триплетов, которые являются транзитивными, деленное на количество триплетов, которые потенциально могут стать транзитивными при добавлении одного ребра. Взаимность дуг измеряет долю дуг, которые являются взаимными, т.е. если узел x посылает связь узлу y, то y также посылает связь узлу x.

Меры сетевой сплоченности часто положительно коррелируют между собой, и поскольку это был наш случай, мы применили анализ главных компонент (PCA), чтобы избежать проблем коллинеарности. Тест Кайзера-Мейера-Олкина (KMO) и тест Бартлетта показали, что для PCA есть возможности (KMO = 0,841, тест Бартлетта на сферичность P < 0,001). В результате PCA был получен один главный компонент с собственными значениями больше 1, который объяснил 85% общей дисперсии. Затем, полученный PC1 (который мы назвали индексом сетевой сплоченности) представлял все вычисленные сетевые показатели. В принципе, чем выше индекс сплоченности сети, тем более связанной и тесной была сеть. Затем мы оценили влияние лечения (зараженные против незараженных, N = 9 против 9), используя LMM с индексом сплоченности сети в качестве переменной ответа, лечением в качестве фиксированного фактора и экспериментом (репликация) в качестве случайного эффекта.
Чтобы проверить, вызывает ли заражение варроа изменения в положении особи в социальной сети, мы сравнили положение особи в сети (насколько особь была центральной в своей социальной сети) у пчел трех категорий: пчел из групп без варроа (V0), пчел без варроа из зараженных групп (V-) и пчел с варроа из зараженных групп (V+). Для каждой особи мы вычислили четыре стандартных показателя центральности узлов (нормализованных внутри сети): взвешенную степень узла, т.е. количество прямых связей фокальной особи с другими особями, взвешенное по силе каждой связи (количество взаимодействий); центральность близости, т.е, среднее расстояние, измеряемое как количество ребер, от данного начального узла до всех других узлов в сети; бета-центральность, которая отражает понятие того, что степень выходит за рамки только первого уровня связей, которые имеет фокальный узел, рассматривая центральность вершин, с которыми связана фокальная вершина; и промежуточность, которая измеряет, как часто узел появляется на кратчайших путях между узлами в сети; и коэффициент кластеризации, который измеряет плотность соседства фокального узла, т.е., степень, с которой связаны ближайшие соседи индивидуума.
Мы вычислили входящие (т.е. полученные) и исходящие (т.е. выполненные) показатели для трех направленных сетевых метрик (взвешенная степень узла, центральность близости и бета-центральность) по отдельности. Например, исходящая взвешенная степень учитывает только взаимодействия, начатые в определенном узле и направленные к другому узлу (например, актором антенны), тогда как входящая близость учитывает только входящие связи (например, получателем антенны). В социальных сетях показатели центральности отдельных узлов часто положительно коррелируют (68, 69). По этой причине мы применили PCA (вращение Varimax) к трем направленным мерам сети (взвешенная степень узла, центральность близости и бета-центральность), чтобы уменьшить количество переменных до меньшего числа некоррелированных главных компонент, таким образом извлекая главные компоненты с собственными значениями больше 1, и затем использовали их в качестве метрик социальной сети в нашем исследовании вместе с коэффициентом связанности и кластеризации. Тесты KMO и Бартлетта показывают, что здесь есть возможности для проведения PCA (KMO = 0,669) и теста Бартлетта на сферичность (P < 0,001). В результате PCA было получено два главных компонента с собственными значениями больше 1, которые вместе объяснили 82,24% общей дисперсии. Результирующий PC1 (который мы назвали индексом исходящей центральности) был представлен взвешенным аутдегри, исходящей бета-центральностью и исходящей близостью. Результирующий PC2 (который мы назвали индексом входящей центральности) был представлен взвешенным индепендентом, входящей бета-центральностью и входящей близостью. В нескольких случаях клещи Варроа перемещались между особями во время эксперимента, и мы исключили из анализа соответствующих особей (N = 16 из 216 особей в целом).

Мы оценили важность категории, а именно: непаразитированные особи группы без варроа (V0), непаразитированные особи группы, зараженной варроа (V-), и паразитированные особи группы, зараженной варроа (V+), на индивидуальную центральность в социальной сети взаимодействия, проведя LMM для каждой меры центральности: исходящая центральность PC1, входящая центральность PC2, промежуточность и коэффициент кластеризации. Мы использовали каждый показатель центральности как зависимую переменную, категорию как фиксированный фактор, а клетку, эксперимент и колонию происхождения как случайные факторы. Для изучения различий между особями V0, V+ и V- использовались пост-хок тесты Тьюки с поправкой на множественные сравнения с помощью FDR. Все метрики социальных сетей были рассчитаны с помощью UCINET v6.665 (70). Статистический анализ проводился с помощью статистического программного обеспечения R.

Благодарности

Мы благодарны А. Х. Диас Франческони за помощь в редактировании рукописи и анонимным рецензентам за полезные комментарии к предыдущим версиям рукописи.

Финансирование: Это исследование финансировалось Университетом Сассари, Италия (FAR2020FLORIS и FAR2020SATTA).

Вклад авторов: И.Ф., М.П. и А.С. разработали дизайн исследования. С.А., М.П. и Е.С. провели эксперименты. S.A., A.C., M.P., A.S. и P.T. выполнили курирование и анализ данных. И.Ф. и А.С. получили финансирование. A.C., M.P. и A.S. написали оригинальную версию статьи. Все авторы внесли значительный вклад в окончательное написание этой статьи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

Доступность данных: Все данные, необходимые для оценки выводов, сделанных в статье, представлены в статье и/или в Дополнительных материалах.

Дополнительные материалы

Этот файл PDF включает:
Рис. S1 — S4
Таблица S1
Легенда для файла данных S1

Скачать

Другие дополнительные материалы к этой рукописи включают следующее:
файл данных S1

Скачать файл

Ссылки и примечания

1. P. Schmid-Hempel, Parasites in Social Insects Vol. 60 (Princeton Univ. Press, 1998).

GOOGLE SCHOLAR

2. S. Cremer, S. A. O. Armitage, P. Schmid-Hempel, Social immunity. Curr. Biol. 17, R693–R702 (2007).