Норвежские медоносные пчелы выживают после заражения клещами Varroa destructor с помощью естественного отбора

Управляемые, одичавшие и дикие популяции европейского подвида медоносной пчелы, Apis mellifera, в настоящее время сталкиваются с серьезной потерей колоний во всем мире. По общему мнению, эктопаразитический клещ Varroa destructor, который поменял хозяев с восточной медоносной пчелы Apis cerana на западную медоносную пчелу A. mellifera, является ключевым фактором, вызывающим эти потери. В течение >20 лет усилия по селекции не привели к появлению колоний европейских медоносных пчел, способных пережить заражение без необходимости борьбы с клещом. Однако, по крайней мере, три популяции европейских медоносных пчел выработали эту способность путем естественного отбора и выживают в течение >10 лет без обработки от клещей. Снижение репродуктивного успеха клещей было предложено в качестве ключевого фактора, объясняющего это естественное выживание. Здесь мы сообщаем об управляемой популяции A. mellifera в Норвегии, которая естественным образом выживает при постоянном заражении V. destructor в течение >17 лет.

Введение

Европейская медоносная пчела, Apis mellifera, является экономически важным насекомым, обеспечивающим необходимые услуги опыления для продовольственной безопасности человека, а также ценные продукты ульев для пчеловодческого сектора (Morse & Calderone, 2000; Klein et al., 2007). Колония медоносных пчел считается суперорганизмом и использует ряд социальных стратегий иммунитета для оптимизации здоровья и приспособленности; особи внутри колонии выполняют гигиенические действия для снижения риска заболевания и инвазии паразитов (Seeley, 1989; Cremer, Armitage & Schmid-Hempel, 2007). Однако в последние годы были зафиксированы крупные потери управляемых и одичавших колоний A. mellifera (например, Kraus & Page, 1995; Neumann & Carreck, 2010; Van Engelsdorp et al., 2011; Pirk et al., 2014). Эктопаразитический клещ Varroa destructor (Anderson & Trueman, 2000) (первоначально поражавший восточную медоносную пчелу Apis cerana) теперь поражает A. mellifera почти во всем мире (Ellis & Munn, 2005). По общему мнению, этот клещ является основным биотическим фактором, угрожающим выживанию колоний A. mellifera (Neumann & Carreck, 2010; Rosenkranz, Aumeier & Ziegelmann, 2010). Клещ является очень эффективным переносчиком нескольких вирусов медоносной пчелы, вызывая эпидемию заболевания в колонии. Это, в сочетании с экспоненциальным ростом популяций клещей, поддерживаемым за счет развития расплода рабочих-хозяев в течение всего года и дополнительного сезонного расплода самцов (Rosenkranz, Aumeier & Ziegelmann, 2010; Dietemann et al., 2012), приведет к тому, что колония будет истощаться, пока не погибнет через 2-3 года (Neumann et al., 2012).

Несмотря на такие серьезные последствия воздействия V. destructor на популяции хозяев A. mellifera, имеются сообщения об управляемых и одичавших популяциях медоносных пчел A. mellifera, которые выжили после заражения клещами благодаря естественному отбору. Эти популяции документируются уже более 10 лет (Авиньон и Ле-Ман, Франция, Le Conte et al., 2007; остров Готланд, Швеция, Fries, Imdorf & Rosenkranz, 2006; Арнот Форест, США, Seeley, 2007; обзор Locke, 2016). На Готланде и в Авиньоне наблюдалось снижение репродуктивного успеха клещей (Locke, 2016), что может способствовать выживанию колоний. Однако до сих пор механизмы, позволяющие выживать зараженным клещами колониям, не были определены.

Было предложено два поведенческих механизма социального иммунитета, способствующих выживаемости V. destructor: один направлен против клещей на форетической стадии, когда они питаются взрослыми пчелами-хозяевами, а другой — на репродуктивной стадии, когда клещи запечатаны в ячейках с расплодом хозяев. В первом случае взрослые рабочие пчелы удаляют форетических клещей с себя и/или сородичей посредством авто- и аллогруминга (Guzman-Novoa et al., 2012). Последнее описывает обнаружение и удаление зараженного клещами расплода взрослыми рабочими пчелами и было определено как часть гигиены, чувствительной к варроа (VSH). Удаление зараженного расплода подавляет вклад этих клещей в следующее поколение и снижает популяцию в колонии (Harbo & Harris, 2009; Harris, Danka & Villa, 2010; Harris, Danka & Villa, 2012). В совокупности эти два вида поведения могут объяснить снижение репродуктивного успеха V. destructor и, в конечном счете, выживание колонии. Однако данных о выживших природных популяциях по-прежнему мало.

Известно, что управляемая популяция местных медоносных пчел выживала в течение >17 лет без обработки от клещей в регионе Остландет в Норвегии. Уровни клещей были анекдотически низкими, несмотря на то, что популяция находилась на достаточном расстоянии от известных восприимчивых колоний различного происхождения (в основном A. m. mellifera, A. m. carnica, Buckfast), что могло бы способствовать горизонтальной передаче паразитов. Целью данного исследования было оценить уровень заражения клещами и репродуктивный успех клещей в этой выжившей популяции, сравнивая с местной и известной восприимчивой популяцией. Также были изучены два вышеупомянутых механизма выживания колоний путем количественной оценки груминга и удаления выводка (VSH) в выживших и восприимчивых колониях.

Материалы и методы

Эксперименты проводились в регионе Остландет, Норвегия, в местных условиях в конце лета и начале осени 2015 года. Выжившие колонии были смешанного происхождения (Buckfast), которые содержались без каких-либо обработок против V. destructor в течение 19 лет до начала исследования. После последней обработки против V. destructor в 1997 году, уровень клещей, казалось, увеличился, и произошла значительная потеря колоний. Однако выжившие и здоровые колонии были разделены и использованы для замены утраченных. За последние 10 лет потери колоний были ниже, чем в среднем по стране — около 10%. Восприимчивые местные контрольные колонии были расположены на расстоянии ∼60 км от выживших пасек в местной природоохранной зоне A. m. carnica и обрабатывались против V. destructor два раза в год. Мы не собирали никаких генетических данных для проверки фактических показателей расового смешения ни выживших, ни восприимчивых колоний, использованных в экспериментах.

Уровень зараженности клещами и доля поврежденных клещей (груминг)

Ежедневное снижение численности клещей считалось надежным показателем численности популяции (Flores, Gil & Padilla, 2015), поскольку ни одна из экспериментальных колоний в год исследования не подвергалась обработке против V. destructor. Показатели оценивались с помощью стандартных методов (Dietemann et al., 2013): Днища колоний были оборудованы сетчатой перегородкой, отделяющей доску для клещей от расплодного ящика, а доски были подготовлены бумажным полотенцем, пропитанным растительным маслом, чтобы предотвратить падающие тела клещей муравьями (Dainat et al., 2011). Доски помещали под подопытные колонии и через шесть дней снова собирали. После того как доски были собраны, все клещи были подсчитаны. Затем общее количество клещей делилось на количество дней, в течение которых доски оставались без присмотра, и усреднялось по колониям, чтобы получить среднесуточную скорость падения клещей для выживших и восприимчивых колоний.

Доля поврежденных клещей использовалась для оценки уровня груминга в колонии. До 20 клещей из каждой колонии исследовали под препаровальным микроскопом и отмечали повреждения карапакса, брюшной пластинки и ног в соответствии с методами, использованными Розенкранцем и др. (1997). Каждый клещ получал бинарную оценку «поврежденный» или «неповрежденный» для анализа, и доля поврежденных клещей была получена для каждой пасеки.

Гигиена, чувствительная к варроа (VSH)

Были отобраны одна выжившая и одна контрольная пасеки: пять колоний из каждой получили по две рамки расплода от одной из десяти восприимчивых местных колоний-доноров на отдельной пасеке, которая географически отличалась от выжившей и контрольной пасек (∼60 км) и аналогично не обрабатывалась в том году. Начальный уровень заражения клещами во всех подопытных колониях был зарегистрирован за два месяца до этого. В данном исследовании учитывался только рабочий расплод, так как мужского полового расплода (трутней) обычно не хватает во время пика численности клещей.

Десять восприимчивых колоний-доноров были выбраны по признакам высокой численности клещей. Каждая из этих колоний-источников передала по одной рамке с рабочим расплодом выжившей и восприимчивой колонии-реципиенту (всего N = 2). Перед перемещением рамок, маток из этих колоний помещали в клетку на каждую из двух пустых рамок в течение двух дней, чтобы получить определенные возрастные когорты расплода. Рамки удаляли из исходных колоний, как только расплод был закрыт. Затем расплодные пятна фотографировали и наносили на карту с обеих сторон, чтобы зафиксировать структуру расплода перед тем, как перенести их в колонии-приемники. Рамки помещали в центр выводковой камеры и оставляли в колониях на 10 дней, чтобы обеспечить созревание за ∼24 часа до появления взрослых особей (Winston, 1991). По истечении отведенного времени рамки извлекали и снова фотографировали, после чего переносили на хранение при -20 °C до исследования.

Каждая открытая ячейка наносилась на распечатанную фотографию расплодного гребня и помечалась как «зараженная» или «незараженная». Если ячейка была очищена и оставлена пчелами пустой, это также отмечалось, что определялось путем сравнения новых фотографий с фотографиями, сделанными до того, как рамки были помещены в тестовые колонии. Число пустых ячеек определялось как доля от общего числа ячеек, исследованных на рамке. Этот показатель вместе с показателями зараженности клещами (Harris, 2007) использовался для оценки уровня VSH в выживших и восприимчивых колониях.

Параметры репродуктивности клещей

Подгруппа ячеек на этих рамках была исследована более детально для получения уровней репродуктивного успеха клещей. После открытия ячейки куколки пчел удалялись с помощью тонкого пинцета. Прилипших к телу клещей счищали маленькой кисточкой. Внутреннюю часть ячейки также тщательно вычищали, чтобы извлечь, но не повредить оставшихся клещей и яйца. После удаления всего содержимого из клетки отмечали стадию развития каждого клеща в соответствии с методикой Мартина (1994).

Мера репродуктивного успеха клещей оценивалась как потенциальное количество жизнеспособных самок, произведенных на одного клеща-найденыша. Потомство считалось жизнеспособным только в том случае, если оно находилось на стадии, достаточной для выживания при появлении хозяина, и если в клетке присутствовал хотя бы один самец (Corrêa-Marques et al., 2003; Locke et al., 2012).

Всем клеткам, в которых не было дочерних клещей, отвечающих этим требованиям, присваивалось нулевое значение. Для каждой колонии среднее число жизнеспособных самок на одну находчицу находили путем подсчета потомства самок, произведенного в одной ячейке, и деления его на число находок в этой ячейке. Стадия расплода оценивалась на основе визуальной таблицы Мартина (1994), и куколкам присваивался номер от 7 до 12, исходя из количества дней, с которыми обычно ассоциируется каждая стадия. Выводок моложе стадии 7 (>170 ч) не учитывался.

Статистика

Для проведения статистического анализа использовали программное обеспечение R (R Core Team, 2014) и пакет LME4 (Bates et al., 2015). Ежедневное падение клещей в колониях было усреднено для выживших и восприимчивых групп, а сравнения проводили с помощью двухвыборочного t-теста. Чтобы учесть большие отклонения, перед проведением статистического анализа данные были лог-трансформированы.

Пропорции поврежденных клещей были собраны, и общая доля зараженных ячеек, а также доля ячеек, гигиенически удаленных пчелами, были объединены по обработке и сравнены с помощью 2 × 2 критериев хи-квадрат. Для репродуктивных параметров клещей использовалась общая линейная модель смешанных эффектов (Bolker et al., 2009). Модели подгонялись по методу максимального правдоподобия, и незначимые члены постепенно удалялись, чтобы получить минимальную адекватную модель, которая лучше всего описывала данные. Параметры усреднялись по рамкам. ID колонии-донора, а также тип колонии-реципиента (выжившая или восприимчивая) учитывались как переменные, чтобы включить эффект парного дизайна (колония-донор предоставляет одну рамку обеим группам обработки), а также вариации на уровне колонии-реципиента. Полная модель представлена ниже:

где «fecund» — среднее число жизнеспособных самок, «trt.col» — тип популяции (выжившая или восприимчивая), «avg.brood.stage» — средняя стадия расплода клеток, проанализированных на данном кадре, а «origin.col» — идентификатор колонии-донора.

Известно, что репродуктивный успех клещей снижается с увеличением числа основательниц в клетке (Fuchs & Langenbach, 1989; Martin, 1995), а потенциальная ошибка оценки потомства больше на более молодых стадиях расплода (Locke et al., 2012). Оба параметра были учтены. Модели были скорректированы для переменной отклика подсчета с использованием пуассоновской структуры ошибок. Дисперсия учитывалась в GLMM с помощью пакета blmeco (Korner-Nievergelt et al., 2015).

Результаты

Одна рамка в группе выживших колоний не содержала расплода после 24-часового периода выращивания маток и поэтому была исключена. Распределения числа подкидышей на ячейку сравнивали между выжившими и восприимчивыми колониями с помощью теста Колмогорова-Смирнова и обнаружили, что они достаточно сходны, чтобы не добавлять их в модели в качестве фиксированного эффекта (D = 0,08, p = 0,49).

Среднесуточное количество клещей было значительно ниже в выживших колониях по сравнению с восприимчивыми (рис. 1A. t = 3,8, df = 15, p = 0,002). Общий средний репродуктивный успех клещей в выживших колониях был значительно снижен и составлял 0,87 потомства на одну находку, в то время как в восприимчивых колониях он составлял 1,24. Снижение репродуктивного успеха клещей составляет ∼30% (табл. 1, рис. 2. χ2 = 4,09, p = 0,027).

Не было существенных различий в доле поврежденных клещей между выжившими и восприимчивыми колониями (рис. 3A. χ2 = 0,12, df = 1, p = 0,73); ∼40% собранных клещей были повреждены в обеих группах. Аналогичным образом, показатели удаления расплода (VSH) существенно не отличались между выжившими и восприимчивыми колониями (рис. 3B. χ2 = 1,88, df = 1, P = 0,171), при этом показатели были близки к 5%. Доля зараженных клеток при сравнении между группами была немного выше в выживших колониях (χ2 = 9,91, df = 1, p = 0,002).

Таблица 1:
Результаты модели общего линейного смешанного эффекта, использованной для анализа среднего числа жизнеспособных самок (плодовитость), уровня заражения расплода и доли удаленных клеток (VSH).

Обсуждение

Наши данные подтверждают мнение, что снижение репродуктивного успеха V. destructor является основным условием для естественного выживания зараженных колоний A. mellifera. Действительно, и репродуктивный успех клещей, и уровень популяции клещей были значительно ниже в выживших норвежских колониях по сравнению с местным восприимчивым контролем. Доля поврежденных клещей как показатель эффективности поведения груминга и удаления расплода (VSH) взрослыми рабочими особями существенно не отличалась между выжившими и восприимчивыми колониями, что указывает на то, что эти два механизма вряд ли объясняют естественное выживание зараженных клещами норвежских медоносных пчел.

Уровень популяции клещей, оцененный по количеству нижних досок, был значительно ниже в выживших колониях по сравнению с местным восприимчивым контролем. Этот результат хорошо согласуется с результатами, полученными ранее для других выживших популяций A. mellifera (Rosenkranz, 1999, обзор Locke, 2016). Более низкий уровень заражения клещами является очевидным объяснением выживания колоний и может быть результатом снижения репродуктивного успеха клещей. Действительно, только около половины клещей в колониях Готланда успешно производят жизнеспособных дочерних клещей, которые вносят вклад в популяцию клещей колонии, по сравнению с ∼80% в местных восприимчивых колониях (Locke & Fries, 2011). Аналогично, репродуктивный успех клещей в выжившей от клещей популяции Авиньона также был снижен на 30% по сравнению с местными восприимчивыми к клещам колониями (Locke et al., 2012). Наши данные также показывают, что репродуктивный успех клещей снижен на ∼30%, тем самым настойчиво предполагая, что такого снижения достаточно для выживания колонии. Поэтому представляется важным понять механизмы, приводящие к снижению репродуктивного успеха клещей.

Несмотря на то, что было показано, что более высокий уровень грумингового поведения снижает инвазию V. destructor у A. mellifera (Guzman-Novoa et al., 2012), наши результаты не выявили существенных различий по грумингу или VSH между местными выжившими и восприимчивыми норвежскими пчелами. Это хорошо согласуется с результатами, полученными ранее на острове Готланд, где различия в гигиеническом и груминг-поведении не были заметны между местными выжившими и восприимчивыми к клещу колониями (Locke & Fries, 2011). Снижение репродуктивного успеха в выживших норвежских и шведских колониях, скорее всего, не связано ни с более чувствительным порогом груминга, ни с более высоким уровнем удаления расплода (VSH). Ни один из протестированных признаков, похоже, не играет большой роли в выживании местных колоний.

Поскольку в наших экспериментах использовался только восприимчивый донорский расплод как в выживших, так и в восприимчивых колониях хозяев, можно смело исключить любые признаки незрелых пчел для объяснения наших данных. Например, изменения в летучести расплода (Nazzi & Le Conte, 2016) не являются фактором, влияющим на полученные результаты. Вместо этого представляется, что для объяснения снижения репродуктивного успеха V. destructor и, в конечном счете, выживания колонии, скорее всего, достаточно различных форм поведения взрослых особей. Эти формы поведения необходимо определить.

При изучении общей доли зараженных клеток в донорских рамках, предоставленных выжившим и восприимчивым колониям, было обнаружено, что рамки для выживших колоний имели большее количество зараженных клеток (∼10%). В данном исследовании мы не можем с уверенностью объяснить разницу в уровне заражения различиями между выжившими или восприимчивыми группами по нескольким причинам: 1. Этот результат не согласуется с подтвержденным нами выводом о низкой численности клещей в нижних досках. 2. Этот результат может быть виной низкого количества рамок и высокой изменчивости количества клещей или метода отбора рамок из колоний-доноров. В будущем следует отслеживать различия в уровне заражения между выжившими и восприимчивыми популяциями с большим размером выборки, чтобы изучить достоверность этого вывода.

В заключение, наши данные подтверждают утверждение о том, что снижение репродуктивного успеха клещей V. destructor, по-видимому, является ключевым фактором выживания колоний в естественных условиях. Однако груминг и VSH маловероятны для этого норвежского случая. Вместо этого, пока еще не идентифицированные поведенческие особенности рабочих пчел кажутся достаточными для объяснения снижения репродуктивного успеха клещей. Механизмы, лежащие в основе этого явления, остаются неустановленными и должны стать предметом будущих исследований с использованием выживших пчел, прошедших естественный отбор.

Эта норвежская популяция медоносных пчел вместе с ранее зарегистрированными независимыми случаями (Locke, 2016) ясно показывают, что европейские подвиды медоносных пчел действительно могут развивать черты для преодоления экстремальных инвазий V. destructor посредством естественного отбора. Поэтому настало время воспользоваться этими случаями и лучше понять адаптацию естественных хозяев (Fries & Bommarco, 2007) для практического применения в пчеловодстве и сохранении медоносных пчел во всем мире.

Ссылки:

Anderson DL, Trueman JWH. 2000. Varroa jacobsoni (Acari: Varroidae) is more than one species.
Experimental & Applied Acarology 24(3):165-189

Bates D, Maechler M, Bolker B, Walker S. 2015. Fitting linear mixed-effects models using lme4.
Journal of Statistical Software 67(1):1-48

Bolker BM, Brooks ME, Clark CJ, Geange SW, Poulsen JR, Stevens MHH, White JSS. 2009. Generalized linear mixed models: a practical guide for ecology and evolution.
Trends in Ecology & Evolution 24(3):127-135

Corrêa-Marques MH, Medina LM, Martin SJ, De Jong D. 2003. Comparing data on the reproduction of Varroa destructor.
Genetic Molecular Research 2(1):1-6

Cremer S, Armitage SA, Schmid-Hempel P. 2007. Social immunity.
Current Biology 17(16):R693-R702

Dainat B, Kuhn R, Cherix D, Neumann P. 2011. A scientific note on the ant pitfall for quantitative diagnosis of Varroa destructor.
Apidologie 42(6):740-742

Dietemann V, Nazzi F, Martin SJ, Anderson DL, Locke B, Delaplane KS, Wauquiez Q, Tannahill C, Frey E, Ziegelmann B+2 more. 2013. Standard methods for varroa research.
Journal of Apicultural Research 52(1):1-54

Dietemann V, Pflugfelder J, Anderson D, Charrière JD, Chejanovsky N, Dainat B, De Miranda J, Delaplane K, Diller F, Fuch S+12 more. 2012. Varroa destructor: research avenues towards sustainable control.
Journal of Apicultural Research 51(1):125-132

Ellis JD, Munn PA. 2005. The worldwide health status of honey bees.
Bee World 86(4):88-101

Flores JM, Gil S, Padilla F. 2015. Reliability of the main field diagnostic methods of Varroa in honey bee colonies.
Archivos de Zootecnia 64(246):161-166

Fries I, Bommarco R. 2007. Possible host-parasite adaptations in honey bees infested by Varroa destructor mites.
Apidologie 38(6):525-533

Fries I, Imdorf A, Rosenkranz P. 2006. Survival of mite infested (Varroa destructor) honey bee (Apis mellifera) colonies in a Nordic climate.
Apidologie 37(5):564-570

Fuchs S, Langenbach K. 1989. Reproduction in Varroa jacobsoni Oud.
Apidologie 20:257-266

Guzman-Novoa E, Emsen B, Unger P, Espinosa-Montaño LG, Petukhova T. 2012. Genotypic variability and relationships between mite infestation levels, mite damage, grooming intensity, and removal of Varroa destructor mites in selected strains of worker honey bees (Apis mellifera L.)
Journal of Invertebrate Pathology 110(3):314-320

Harbo JR, Harris JW. 2009. Responses to Varroa by honey bees with different levels of Varroa Sensitive Hygiene.
Journal of Apicultural Research 48(3):156-161

Harris JW. 2007. Bees with Varroa Sensitive Hygiene preferentially remove mite infested pupae aged ≤ five days post capping.
Journal of Apicultural Research 46(3):134-139

Harris JW, Danka RG, Villa JD. 2010. Honey bees (Hymenoptera: Apidae) with the trait of Varroa sensitive hygiene remove brood with all reproductive stages of Varroa mites (Mesostigmata: Varroidae)
Annals of the Entomological Society of America 103(2):146-152

Harris JW, Danka RG, Villa JD. 2012. Changes in infestation, cell cap condition, and reproductive status of Varroa destructor (Mesostigmata: Varroidae) in brood exposed to honey bees with Varroa sensitive hygiene.
Annals of the Entomological Society of America 105(3):512-518

Klein AM, Vaissiere BE, Cane JH, Steffan-Dewenter I, Cunningham SA, Kremen C, Tscharntke T. 2007. Importance of pollinators in changing landscapes for world crops.
Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences 274(1608):303-313

Korner-Nievergelt F, Roth T, Felten S, Guelat J, Almasi B, Korner-Nievergelt P. 2015.
Bayesian data analysis in ecology using linear models with R. London: Elsevier.

Kraus B, Page RE. 1995. Effect of Varroa jacobsoni (Mesostigmata: Varroidae) on feral Apis mellifera (Hymenoptera: Apidae) in California.
Environmental Entomology 24(6):1473-1480

Le Conte Y, De Vaublanc G, Crauser D, Jeanne F, Rousselle JC, Bécard JM. 2007. Honey bee colonies that have survived Varroa destructor.
Apidologie 38(6):566-572

Locke B. 2016. Natural Varroa mite-surviving Apis mellifera honeybee populations.
Apidologie 47(3):467-482

Locke B, Conte YL, Crauser D, Fries I. 2012. Host adaptations reduce the reproductive success of Varroa destructor in two distinct European honey bee populations.
Ecology and Evolution 2(6):1144-1150

Locke B, Fries I. 2011. Characteristics of honey bee colonies (Apis mellifera) in Sweden surviving Varroa destructor infestation.
Apidologie 42(4):533-542

Martin SJ. 1994. Ontogenesis of the mite Varroa jacobsoni Oud. in worker brood of the honeybee Apis mellifera L. under natural conditions.
Experimental & Applied Acarology 18(2):87-100

Martin SJ. 1995. Reproduction of Varroa jacobsoni in cells of Apis mellifera containing one or more mother mites and the distribution of these cells.
Journal of Apicultural Research 34:187-196

Morse RA, Calderone NW. 2000. The value of honey bees as pollinators of US crops in 2000.
Bee Culture 128(3):1-15

Nazzi F, Le Conte Y. 2016. Ecology of Varroa destructor, the major ectoparasite of the western honey bee, Apis mellifera.
Annual Review of Entomology 61:417-432

Neumann P, Carreck NL. 2010. Honey bee colony losses.
Journal of Apicultural Research 49(1):1-6

Neumann P, Yañez O, Fries I, De Miranda JR. 2012. Varroa invasion and virus adaptation.
Trends in Parasitology 28:353-354

Pirk CW, Human H, Crewe RM, Van Engelsdorp D. 2014. A survey of managed honey bee colony losses in the Republic of South Africa—2009 to 2011.
Journal of Apicultural Research 53(1):35-42

R Core Team. 2014. R: a language and environment for statistical computing.
Vienna: R foundation for Statistical Computing. software

Rosenkranz P. 1999. Honey bee (Apis mellifera L.) tolerance to Varroa jacobsoni Oud. in South America.
Apidologie 30(2–3):159-172

Rosenkranz P, Aumeier P, Ziegelmann B. 2010. Biology and control of Varroa destructor.
Journal of Invertebrate Pathology 103:S96-S119

Rosenkranz P, Fries I, Boecking O, Stürmer M. 1997. Damaged Varroa mites in the debris of honey bee (Apis mellifera L) colonies with and without hatching brood.
Apidologie 28(6):427-437

Seeley TD. 1989. The honey bee colony as a superorganism.
American Scientist 77(6):546-553

Seeley TD. 2007. Honey bees of the Arnot Forest: a population of feral colonies persisting with Varroa destructor in the northeastern United States.
Apidologie 38(1):19-29

Van Engelsdorp D, Hayes jr J, Underwood RM, Caron D, Pettis J. 2011. A survey of managed honey bee colony losses in the USA, fall 2009 to winter 2010.
Journal of Apicultural Research 50(1):1-10

Winston ML. 1991. 

The biology of the honey bee. Cambridge: Harvard University Press.