Оценка подавленного размножения клещей (SMR) выявляет потенциал устойчивости к варроа у европейских медоносных пчел (Apis mellifera L)

Простое резюме

Клещ Varroa destructor представляет собой большую угрозу для медоносных пчел и пчеловодческой отрасли. Возможность отбора и разведения медоносных пчел, которые от природы способны бороться с клещом, является устойчивым решением. Это может быть достигнуто путем оценки неудачи размножения клещей (SMR, suppressed mite reproduction). Мы провели большой европейский эксперимент по оценке признака SMR в различных популяциях медоносных пчел, распространенных в 13 странах и представляющих различные популяции медоносных пчел. Первая цель заключалась в стандартизации и проверке метода оценки SMR, а затем в сравнении признака SMR между различными популяциями. Наши результаты показывают, что для надежной оценки показателя SMR любой данной колонии необходимо исследовать не менее 35 расплодных ячеек, зараженных одним клещом. Несколько колоний из нашего набора данных демонстрируют высокие показатели SMR, что указывает на присутствие этого признака в европейских популяциях медоносных пчел. Не удалось выявить существенных различий между странами для данной популяции или между популяциями в разных странах. Данное исследование показывает потенциал для увеличения усилий по селекции для выведения популяций медоносных пчел, устойчивых к V. destructor.

Аннотация

В борьбе с клещом Varroa destructor селекционное разведение популяций медоносных пчел (Apis mellifera L.), устойчивых к паразитическому клещу, является устойчивым решением. Селекционные инициативы показывают, что использование признака подавления размножения клещей (SMR) в качестве критерия отбора является подходящим инструментом для разведения таких устойчивых популяций пчел. Мы провели большой европейский эксперимент по оценке признака SMR в различных популяциях медоносных пчел, распространенных в 13 странах и представляющих различные генотипы медоносных пчел с их местными паразитами клещей. Первая цель заключалась в стандартизации и проверке метода оценки SMR, а затем в сравнении признака SMR между различными популяциями. Результаты моделирования показывают, что для надежной оценки показателя SMR любой данной колонии необходимо исследовать не менее 35 одиночных зараженных клеток. Несколько колоний из нашего набора данных демонстрируют высокие показатели SMR, что указывает на присутствие этого признака в европейских популяциях медоносных пчел. Этот признак сильно варьирует между колониями и некоторыми странами, но не удалось выявить существенных различий между странами для данного генотипа или между генотипами в разных странах. Это исследование показывает потенциал для увеличения усилий по селекции популяций, устойчивых к V. destructor.

1.Введение

Инвазивный паразитический клещ Varroa destructor является одной из основных причин гибели колоний медоносных пчел (Apis mellifera L.) [1,2,3,4,5]. В Европе, где клещ был впервые завезен в 1970-х годах, варрооз является серьезной проблемой для пчеловодства [6,7,8]. Во многих странах пчеловоды часто применяют органические или синтетические акарициды, чтобы избежать потери колоний. Однако может развиться устойчивость к химическим препаратам, что делает их применение бесполезным [9,10,11,12]. Кроме того, обработка клещей химиотерапевтическими препаратами может вызвать неблагоприятные последствия для медоносных пчел [13,14] и может оставить остатки в продуктах жизнедеятельности ульев [15,16].

Для преодоления этих проблем необходимо разработать устойчивый подход с долгосрочной перспективой. Селекция и разведение пчел, способных противостоять клещу варроа, будет способствовать такой стратегии. Популяции медоносных пчел, способные выживать после заражения варроа без лечения, хорошо описаны, и подробные исследования позволили понять основные механизмы [17,18,19,20,21]. Изучение соответствующих признаков, которые можно использовать для селекции на повышение устойчивости к варроа, началось еще в 1990-х годах, и с тех пор несколько селекционных программ дали многообещающие результаты [22,23,24,25]. В данной работе мы используем термин «устойчивость» в соответствии с определением [26], поскольку при этом нарушается приспособленность клеща.

Среди многочисленных механизмов, известных для ограничения роста популяции клещей варроа, важную роль играет подавление размножения клещей (SMR), которое наблюдается в естественно устойчивых популяциях с Готланда и Авиньона [27,28]. Этот признак, впервые описанный [29], относится к клещам, которые входят в выводковую клетку для завершения своего репродуктивного цикла, но в итоге не производят зрелых и спаренных самок. Подавление размножения клещей считается признаком на уровне колонии и определяется долей рабочих выводковых клеток, содержащих не размножающихся материнских клещей. Было установлено, что этот признак наследуется [30] и используется в селекционных программах США с конца 1990-х годов [31,32,33]. Такие линии используются несколькими коммерческими пчеловодами, но до сих пор не сообщалось о крупномасштабных пчеловодческих практиках, которые воздерживаются от регулярных обработок против варроа. Однако в европейских селекционных программах этому признаку пока не уделяется особого внимания, и данные об изменчивости репродуктивного успеха клещей и распределении признака в неустойчивых, управляемых популяциях медоносных пчел по всей Европе отсутствуют. Более того, при начале любых попыток селекции по признаку SMR в данной среде важно проверить местную популяцию на наличие и изменчивость SMR и таким образом оценить ее потенциал для селекции.

Фенотип SMR может быть вызван несколькими различными механизмами и может происходить от особенностей хозяина и/или паразита. SMR может быть косвенным результатом поведения взрослых пчел, такого как чувствительная к варроа гигиена (VSH) или поведение, связанное с укупоркой [34,35]. Механизмы физиологии или поведения расплода также могут влиять на способность варроа к размножению [36,37,38], но они остаются неизвестными. Особенности паразитов также могут влиять на размножение варроа, например, вариации генотипов клещей [39,40] или физиологический статус клещей, вторгающихся в клетки.

Чтобы предоставить исходные данные для региональных программ селекции, мы начали общее исследование для оценки присутствия SMR в местных европейских популяциях медоносных пчел в зависимости от географического положения и генотипов. Мы разработали общий протокол для точного определения доли ненормально размножающихся клещей в данной колонии и обеспечения совместимости данных между участниками. Мы провели моделирование, чтобы оценить точность оценок ВСР и оптимизировать будущие исследования. Мы также обсуждаем потенциальные механизмы, которые могут присутствовать в различных размножающихся колониях, такие как поведение пчел, физиологические особенности расплода или особенности паразитов.

2. Материалы и методы

2.1. Колонии медоносных пчел и стратегия отбора проб

Это исследование проводилось 17 лабораториями в 13 европейских странах (Таблица 1) в течение лета и осени 2015 и 2016 годов. Всего было оценено 414 колоний, распределенных по 68 пасекам и управляемых участвующими институтами или пчеловодами-партнерами.

Страна	Лаборатория	Генотипы	Образцы (≥10 SIC)	Образцы (≥35 SIC)
Croatia (Hr)	HPA	carnica	12	7
	OS	carnica	16	12
Denmark (Dk)	Dk	Buckfast	6	2
France (Fr)	INRA	Buckfast, mellifera mix, VSH	56	34
	ITSAP	Buckfast, caucasica,  carnica mix,  ligustica mix	39	3
Germany (De)	LLH Bee Institute	carnica	105	35
Greece (Gr)	HAO-API	cecropia,  macedonica	15	0
Italy (It)	CREA-API	ligustica	12	2
	Aspromiele	Buckfast	20	0
Lithuania (Lit)	Vilnius	carnica mix	10	0
R. of Moldova (Mol)	IZASM	carpatica	23	13
Norway (Nor)	NBA	mellifera	10	1
Poland (Pol)	Pulawy	carnica, caucasica,  mellifera	17	7
	Olsztyn	carnica	29	9
Portugal (Por)	CIMO	iberiensis	7	0
Romania (Rom)	ICDA	carpatica	23	19
Switzerland (Sw)	Liebefeld	carnica mix	14	2
Итого			114	176

Экспериментальные колонии были получены из запасов, содержащихся в участвующих институтах, и, согласно экспертному мнению соответствующих экспериментаторов, принадлежали к европейским подвидам, местным гибридам или местным популяциям Apis mellifera (A. m. carnica, A. m. caucasica, A. m. cecropia, A. m. iberiensis, A. m. ligustica, A. m. macedonica, A. m. mellifera, A. m. carpatica, Buckfast и гибриды Carnica, Ligustica и Mellifera), далее упоминаемые как «генотипы». Хотя генетический скрининг для подтверждения подвидового происхождения не проводился, популяции представляют собой отдельные местные популяции и могут рассматриваться как различные генотипы. Отобранные колонии были случайным образом выбраны из каждой местной популяции. Мы также включили 23 колонии из двух популяций, которые были предварительно отобраны на устойчивость к варроа: гибриды A. m. mellifera из французской выжившей от варроа популяции [17] и колонии, содержащие гибридных королев A. m. mellifera, искусственно осемененных спермой, собранной из колоний программы разведения VSH (чувствительных к варроа) (Данка и др., USDA Baton Rouge, США) [31]. Сводная информация об участвующих институтах, лабораториях, соответствующих генотипах и количестве исследованных образцов представлена в таблице 1.

2.2. Оценка отсутствия размножения клещей

Надежная оценка стадий развития потомства клещей требует от эксперта значительного уровня знаний, навыков и опыта. В частности, самок протонимф и самцов трудно отличить друг от друга [6,41], и их правильная идентификация может быть затруднена. Для улучшения и повышения надежности измерений в настоящем исследовании был разработан стандартизированный протокол, включающий подробные фотографии соответствующих стадий развития куколок пчел и потомства клещей, который был распространен среди всех участников эксперимента [42]. Кроме того, все участники исследования имели возможность приобрести опыт, посетив учебный семинар, где был продемонстрирован и отработан метод подсчета баллов.

Для определения доли клещей, которые заразили выводковые ячейки, но не смогли размножиться, из каждой колонии отбирали рамку с рабочим расплодом на поздних стадиях развития (куколки с пурпурными глазами и белым телом или старше, т.е. по крайней мере через 7 дней после закрытия) и оценивали в лаборатории. Рамки препарировали свежими, когда это было возможно, или после хранения (в течение 1-6 месяцев) при -20 °C.

На каждой рамке, содержащей гребни, случайным образом выбирали расплодные ячейки и осторожно вскрывали их под стереомикроскопом. Если ячейка была заселена, определяли стадию развития куколки. В соответствии с морфологическими характеристиками выделяли три стадии: <7 дней после откладки (куколки с глазами светлее темно-фиолетового), 7-9 дней после откладки (куколки с темными глазами и светлой окраской тела) и 10-12 дней после откладки (куколки с темной окраской тела). Основным критерием для разграничения между 9 и 10 днем после укупорки было наличие серых подушечек крыльев на 10 день. Кроме того, тщательно оценивали состав семьи клещей, регистрируя количество клещей-найденышей, стадию развития потомства старшей самки и, по желанию, наличие и стадию развития потомства самцов. Таблица, описывающая нормальное развитие потомства клещей по отношению к развитию куколок пчел, использовалась для определения того, произведет ли клещ-найденыш хотя бы одну спарившуюся дочь к моменту выхода пчелы из ячейки (рис. 1).

Оценивались только одиночные зараженные выводковые ячейки (только один клещ-находка), содержащие куколок старше 7 дней после отлова, поскольку невозможно определить успешность размножения клещей на более ранних стадиях и в случае множественного заражения. Клещ-найденыш считался репродуктивным, если он сопровождался потомством, по крайней мере, такого же возраста, как указано в таблице (Рисунок 1). На стадии 7-9 дней после укуса нормально размножающиеся клещи имеют по крайней мере одного дейтонимфа или взрослого сына и одну дочь-дейтонимфа. На стадии 10-12 дней после укупорки нормально размножающиеся клещи имеют по крайней мере одного взрослого сына и одну взрослую дочь. Находка считалась нерепродуктивной, если потомство было моложе (отложенное размножение), если самец отсутствовал (отсутствие самца) или если потомство отсутствовало (бесплодный клещ). Более подробную информацию о протоколе и больше иллюстраций можно найти на сайте www.beebreeding.net.

На каждом гребне препарировали ячейки до тех пор, пока не было выявлено не менее 10, а по возможности 35 зараженных ячеек. Интенсивность заражения расплода оценивалась как количество клеток, содержащих клещей, по отношению к общему количеству проверенных клеток, а показатель SMR рассчитывался как доля зараженных клеток, содержащих нерепродуцирующих клещей.

2.3. Имитационный анализ

Теоретические расчеты были проведены для определения влияния количества вскрытых зараженных клеток на точность оценки ВСР. Учитывая число вскрытых одиночных зараженных клеток (SIC) (i) и истинное значение ВСР (s), наблюдаемое число невоспроизводящихся клеток (r) можно считать случайным. Чтобы учесть изменчивость r, процесс выборки усреднялся по всем возможным значениям r:

где P(s˜|r,i) следует бета-распределению с параметрами (1+r, 1+i-r), а P(r|i,s) — биномиальному распределению с параметрами i и s. Следовательно, распределение оценок ВСР (s˜) представляет собой смесь бета-распределений. Эти распределения были получены для различных значений SIC и SMR.

На втором этапе, чтобы улучшить оценку ВСР, все колонии моделировались совместно, чтобы собрать силу по колониям и получить более надежные оценки ВСР для колоний, которые были оценены с небольшим SIC. Этот иерархический подход предполагает, что истинные значения ВСР колоний возникают из общего бета-распределения Beta (a, b). В байесовском подходе бета-распределение является предварительным распределением для ВСР. Поскольку многие колонии были оценены по ВСР, параметры предшествующего распределения могут быть фактически получены из данных с помощью эмпирической стратегии Байеса: сначала получают исходные значения оценок ВСР (r/SIC), затем, основываясь на глобальных распределениях этих оценок, оценивают параметры предшествующего распределения методом максимального правдоподобия. Наконец, вычисляются апостериорные средние для всех колоний и используются в качестве робастных оценок ВСР.

2.4. Статистический анализ

Все статистические анализы и рисунки были выполнены в среде R (версия 3.3.1). Колонии рассматривались как отдельные особи. Связь между степенью заражения расплода и показателем SMR проверяли с помощью корреляционных тестов Пирсона. В связи с характером экспериментальной схемы и данных (пропорциональные данные), анализ проводился с использованием обобщенных линейных моделей (GLM-пакет lme4), а поскольку было установлено квази-распределение, в дальнейшем использовались тесты Фишера. В случае сравнения внутри группы карника использовалась обобщенная линейная модель смешанных эффектов (GLMM). Для учета того факта, что колонии могут принадлежать одной пасеке в этом последнем случае, идентичность пасек была включена как случайный фактор, наряду с эффектом лечения как фиксированной объясняющей переменной (генотип, страна или уровень ВСР). Попарное сравнение уровней факторов проводилось с помощью post-hoc тестов (fdr или Tukey).

3. Результаты

3.1. Изменчивость ВСР в различных европейских странах

Описательный анализ на основе полного набора данных (≥10 SIC на колонию, n = 414 колоний) позволил получить общий средний показатель SMR 32,8% ± 16,8 и медиану 31,4%. Показатель SMR колоний, которые не были предварительно отобраны на устойчивость к дрозофиле, варьировался от 0 до 100%. В целом, большинство колоний показали оценку от 0 до 50%, при этом 15,9% колоний показали оценку SMR, равную или превышающую 50% (рис. 2A).

Однако медиана и диапазон показателей ВСР существенно различались в разных странах, где проводилось исследование, и составляли от 4,0% ± 10,6 (Дания) до 24,5% ± 16,9 (Италия) (Рисунок 2B).

3.2. Усовершенствование протокола для оценки надежного балла ВСР

Оценка истинного показателя SMR варьирует в зависимости от самого истинного показателя SMR и от количества открытых клеток (Рисунок 3A). Вариация несимметрична для малых и больших значений SMR, когда SIC мала (<10). Например, высокий показатель SMR (0,7) скорее занижен, чем завышен, а низкий показатель SMR (0,2) скорее завышен, чем занижен. Независимо от показателя ВСР существует высокая вариабельность в его оценке, особенно для малых НИЦ. Например, при 10 НИЦ и истинном значении ВСР 0,35 измеренный показатель ВСР может быть завышен до уровня выше 0,5 с вероятностью 24%, и даже может быть завышен до уровня выше 0,7 с вероятностью 4%. Вариабельность была дополнительно оценена путем рассмотрения функции кумулятивной плотности оценки ВСР (Рисунок 3B). Очевидно, что 10 SIC недостаточно для получения оценки ВСР с удовлетворительной вариабельностью (максимум ± 30% от необработанной вариабельности, Таблица S1). Тридцать пять SIC является минимальным требованием, при котором вариабельность более приемлема (макс. ± 20% от необработанной вариабельности). Этот результат подтверждается распределением Эмпирического Байеса, где расстояние до идентичного распределения является приемлемым, когда число SIC больше 30 (Рисунок 3C). При таком подходе к сокращению, четко видно, что колонии, оцененные с помощью всего нескольких SIC (<15), имеют расчетные значения сильно сокращенные по сравнению с их необработанным значением, что еще раз подчеркивает их низкую надежность. Анализ ВСР с использованием 100 SIC обеспечил бы идеальное снижение изменчивости (ок. ± 12%), но для оценки осуществимости такого стандарта необходимо рассмотреть практические аспекты в полевых и лабораторных условиях.

3.3. Изменчивость ВСР у различных генотипов медоносной пчелы

На основании данных колоний, имеющих не менее 35 SIC, между различными генотипами наблюдались значительные различия по показателю SMR (Рисунок 4A-GLM: F = 6,758, p < 1,49 × 10-7): A. m. caucasica, A. m. ligustica, A. m. mellifera, а также гибриды Carnica и Ligustica имели более высокие показатели SMR, чем A. m. carnica, Buckfast, A. m. carpatica и гибриды Mellifera.

Генотипы A. m. carnica были отобраны в трех разных странах (Германия, Хорватия и Польша). Колонии из Германии имели тенденцию демонстрировать более высокие показатели SMR, чем колонии из Хорватии и Польши, но различия не были значительными (Рисунок 4B-GLMM: χ2 = 4,85, p = 0,088). Важно отметить, что в пределах одного генотипа и в пределах одной страны изменчивость показателей ВСР может быть особенно высокой. Например, в Германии пчелы A. m. carnica демонстрировали показатели SMR от 14,2% до 65,7%.

Колонии из предварительно отобранных популяций с повышенной устойчивостью к варроа демонстрировали значительно более высокий показатель SMR, чем не отобранные (Рисунок 5-GLM: F = 86,32, p = 6,77 × 10-7).

3.4. Предполагаемые механизмы для ВСР

На основании данных колоний с не менее чем 35 SIC (n = 159 колоний, из 10 разных стран), не было выявлено значительной корреляции между скоростью заражения расплодом и показателем SMR (Рисунок 6A-t = -1,48, p = 0,14).

Кроме того, причина классификации зараженной выводковой ячейки как нерепродуктивной была исследована на основе следующих физиологических критериев клещей: задержка размножения, отсутствие самца или бесплодие (отсутствие потомства). Эти три критерия были проанализированы в шести странах (Германия, Франция, Польша, Хорватия, Молдова и Румыния), где были выявлены колонии, содержащие не менее 10 нерепродуктивных клещей (Рисунок 6B). Доля клеток, классифицированных как нерепродуктивные из-за отсутствия самца, значительно отличалась между странами (GLM: F = 6,68, p = 3,33 × 10-8). По сравнению с Германией, во Франции была выявлена более высокая доля клеток без самцов варроа (Fisher post-hoc: t = -7,38, p = 5,2 × 10-11). Аналогично, доля клеток, классифицированных как нерепродуктивные из-за бесплодия, значительно отличалась (GLM: F = 6,56, p = 2,59 × 10-5). По сравнению с Германией, Молдова (Fisher post-hoc: t = -3,25, p = 0,0016) и Польша (Fisher post-hoc: t = -3,98, p = 0,00013) имели меньшую долю бесплодных клеток, зараженных варроа.

Причина неудачного размножения самок-основательниц варроа была далее исследована на том же наборе данных в зависимости от степени SMR колонии, которая была классифицирована как низкая (<34%, меньше среднего SMR в исследовании), средняя (35-49%) или высокая (>50%, соответствует потенциально устойчивым колониям) (Рисунок 6C). Аналогичные доли нерепродуцирующих клеток из-за отсутствия самца были обнаружены во всех трех категориях ВСР (GLM: F = 1,11, p = 0,33). Аналогичный результат был обнаружен для доли бесплодных клеток (GLM: F = 0,75, p = 0,48) и для доли клеток с задержкой развития (GLM: F = 2,25, p = 0,11). В целом, не было обнаружено корреляции между показателем SMR и долей отсутствующих самцов (Пирсон: t = 1,52, p = 0,13), бесплодных подкидышей (Пирсон: t = 0,62, p = 0,54) или отложенного воспроизводства (Пирсон: t = -1,65, p = 0,10).

4. Обсуждение

4.1. Признак ВСР в европейских колониях

Подавление размножения клещей (SMR) было признано важным признаком для выживания в естественно устойчивых популяциях медоносных пчел [24,28] и было успешно внедрено в селекционные программы в США [22,31,43,44]. В отличие от этого, помимо исследований в естественно устойчивых популяциях [21,27,28], распространение признака SMR в европейских популяциях медоносных пчел еще не получило серьезного научного внимания. Большинство усилий по селекции устойчивости к варроа в Европе до недавнего времени основывались на интродукции неместного устойчивого поголовья, однако эти попытки не увенчались успехом [28,45]. Фактором, способствующим неудаче таких попыток, может быть взаимодействие генотипа и окружающей среды [46], способствующее адаптации колоний к преобладающим условиям окружающей среды [47]. При начале любых попыток селекции по признаку ВСР в данной среде важно провести скрининг местной популяции на наличие и изменчивость ВСР и тем самым оценить его потенциал для селекции.

В настоящем исследовании мы проверили 414 колоний на всем европейском континенте, чтобы получить полный набор данных, описывающих основную вариабельность нерепродукции клещей в Европе, которые могут служить в качестве исходных данных для принятия селекционных решений в перспективных селекционных программах. Чтобы получить первый общий обзор распространения и изменчивости ВСР в Европе с приемлемыми трудозатратами, каждая участвующая лаборатория исследовала свои колонии на основе не менее 10 однократно зараженных клеток. На основе этих данных мы наблюдали большую изменчивость ВСР в различных популяциях медоносных пчел, при этом средняя доля нерепродуцирующих клещей достигала 32,8%, а почти 16% колоний превышали 50% (по результатам наблюдений на основе минимум 10 однократно зараженных ячеек).

На следующем этапе было проведено дальнейшее изучение вариаций успешности размножения клещей в различных генотипах медоносных пчел путем исследования не менее 35 однократно зараженных ячеек. Результаты показали, что некоторые генотипы работают значительно лучше, чем другие, причем три из них (по одному из caucasica, ligustica и mellifera) показали сравнительно высокие результаты. Однако количество исследованных колоний было довольно небольшим, и для подтверждения этого наблюдения необходимы дополнительные эксперименты. Учитывая, что в среднем от 5% до 20% клещей-найденышей остаются бесплодными у европейских медоносных пчел [6], а коэффициент размножения клещей от 0,78 до 0,9 был зарегистрирован в предыдущих исследованиях [27,48], настоящие результаты показывают, что значительная часть популяций медоносных пчел в Европе может иметь потенциал для отбора на повышенную устойчивость (sensu [26]) к V. destructor. Это также подтверждается тем фактом, что показатели SMR колоний, происходящих из предварительно отобранного поголовья, были последовательно и значительно выше, чем показатели не отобранных генотипов. Настоящие показатели, наблюдаемые как во французской выжившей популяции (0,47 ± 0,12), так и в гибридном генотипе VSH (0,57 ± 0,11), находились в диапазоне предыдущих результатов, полученных во французской популяции (0,59 ± 0,02) и в популяции, выжившей от клещей с острова Готланд (0,48 ± 0,02) [27,28].

4.2. Факторы, влияющие на измерение ВСР

Хотя настоящие результаты показывают, что устойчивость колоний медоносных пчел к V. destructor во многих европейских популяциях пчел действительно может быть улучшена путем селекции на повышенный SMR, несколько факторов могут представлять трудности для создания и реализации такого подхода к селекции. Получение надежной оценки способности данной колонии подавлять размножение клещей является сложной и трудоемкой задачей. Кроме того, на оценку может влиять ряд различных факторов, таких как количество доступного выводка рабочих и трутней [49] или заселенность колоний клещами. Количество потомства на одного клеща имеет тенденцию к снижению при высоких уровнях заражения [50], что может смещать наблюдаемые показатели ВСР в сторону увеличения. Несмотря на высокие уровни заражения, обнаруженные в некоторых колониях (до 80% в выводке), в настоящем исследовании не наблюдалось корреляции между нагрузкой клещей и показателями ВСР. Однако такие эффекты являются сложными и требуют дальнейшего изучения, поскольку они могут взаимно отменять друг друга. Например, колонии с высокой экспрессией SMR могут регулировать общее количество V. destructor в колонии, в то время как колонии с низкой инвазией клещей могут не вызывать поведения, приводящего к высоким значениям SMR. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы подтвердить, может ли на SMR также влиять другие факторы окружающей среды, подобно тому, как это было показано для гигиенического поведения и наличия пищи или вирусных инфекций [51,52,53]. Кроме того, хотя ВСР был описан как наследственный признак [30,54], оценки наследственности в настоящее время недоступны ни для одной популяции.

Надежность оценки ВСР в значительной степени зависит от количества однократно зараженных клеток, которые вскрываются и оцениваются. Хотя для наилучшей оценки балла данной колонии требуется оценка большого числа одиночных заселенных расплодом ячеек, как можно ближе к общему числу таких ячеек в колонии, такой подход, очевидно, не является практически осуществимым. В предыдущих исследованиях количество наблюдений на колонию не было точно определено, но обычно варьировалось между 10 и 35 [27,49,55]. Для оценки надежности подсчета баллов мы провели имитационный анализ на основе различного количества наблюдений и различных уровней ВСР. Результаты показали, что оценка балла SMR на основе небольшого числа одиночных зараженных клеток варьировала в широких пределах, а подсчет на основе десяти наблюдений может привести к занижению или завышению истинного балла SMR в пределах 30%. Даже когда оценка была основана на 35 единичных зараженных клетках, оставались значительные колебания вокруг истинного балла ВСР.

Повторные измерения, как это делается для VSH [56], могли бы повысить надежность, однако временное окно для оценки SMR очень узкое, что добавляет еще один уровень сложности для применения этого признака в селекции. В большинстве колоний уровень заражения клещами в расплоде может быть очень низким в начале сезона [57], а уровень, позволяющий оценить ВСР с приемлемыми затратами времени и труда, возможен только после пика развития, в короткий период между концом лета и началом осени. Что еще более усложняет ситуацию, поскольку высокая выраженность признака SMR приводит к снижению заселенности расплодом, в таких колониях может становиться все труднее найти достаточное количество одиночных заселенных клеток для надежного подсчета даже в конце сезона. Одной из возможных альтернатив может быть измерение SMR в выводковых рамках, которые были подвержены высокому уровню заражения, путем помещения их в колонии-доноры клещей во время открытой стадии. Однако эта альтернативная процедура не отражает естественную ситуацию, а интродукция клещей иностранного происхождения может привести к необъективной оценке [34]. В совокупности эти проблемы могут лежать в основе нежелания селекционеров интегрировать и использовать признак SMR в селекционных программах [58].

4.3. Триггеры для ВСР

Разработка простого биоанализа для оценки потенциала SMR колонии является сложной задачей, и факторы, ответственные за SMR, требуют дальнейшего изучения. Фенотип SMR может быть вызван несколькими различными механизмами и может происходить от особенностей хозяина и/или паразита. Факторы хозяина, по-видимому, играют центральную роль в некоторых популяциях, поскольку смена матки может привести к изменению фенотипа SMR [59]: (i) SMR может быть косвенным результатом гигиенического поведения, чувствительного к варроа (VSH), когда взрослые пчелы предпочтительно выбирают расплод, зараженный размножающимися клещами [34], но оставляют нетронутыми ячейки расплода, содержащие не размножающихся клещей. (ii) Самки клещей, вырвавшиеся из клеток, нацеленных на VSH, могут выжить и попасть в новую клетку для размножения, но из-за того, что их предыдущий цикл размножения прервался, они могут столкнуться с повышенным риском неудачного размножения. Этот механизм еще предстоит подтвердить, несмотря на то, что в некоторых популяциях была обнаружена высокая корреляция между уровнем VSH и SMR [34,60,61]. (iii) Откупоривание, которое заключается во вскрытии и последующем укупоривании пчелами целевых ячеек, также может влиять на репродуктивную способность клещей в целевом расплоде. В эксперименте по искусственному откупориванию/откупориванию было показано, что в целевых ячейках снижается уровень размножения варроа [35], а выжившие в естественных условиях популяции, демонстрирующие повышенные показатели SMR, также демонстрируют высокие показатели откупоривания [21,35]. (iv) Физиологические или поведенческие особенности самого расплода также могут влиять на способность варроа к размножению [36,37,38], хотя точные механизмы, посредством которых расплод может ухудшить размножение варроа, остаются неизвестными.

Тем не менее, особенности паразита также могут влиять на размножение варроа. Недавние исследования показали, что генетическая вариативность клещей выше, чем предполагалось ранее [39,40], и такие результаты могут способствовать улучшению понимания взаимодействия между генотипами колоний хозяев и их паразитов. Физиологический статус клещей, вторгающихся в клетки, также может играть важную роль. Например, существуют убедительные свидетельства того, что репродуктивный успех клещей может снижаться после длительного пребывания взрослых пчел без доступа к расплоду. Оттен [62] описывает значительные сезонные различия в репродуктивном успехе клещей, с самыми низкими уровнями (70%) в конце зимы и высокими значениями (до 90%) в июле. Последние исследования также показывают, что успех размножения клещей снижается после периодов без расплода, например, в результате длительного содержания королевы в клетке или применения гребней-ловушек в качестве комплексных мер борьбы с варроа [63], или в контексте роения [64].

Неспособность клещей к размножению, независимо от того, зависит ли она от механизмов хозяина и/или паразита или факторов окружающей среды, может характеризоваться тремя различными особенностями размножения клещей: бесплодие клеща, т.е. полное отсутствие потомства, отсутствие самца, что препятствует спариванию самки с потомством, или задержка в откладке яиц и/или развитии потомства, что препятствует достижению клещами взрослой стадии до появления развивающейся пчелы. Каждый из этих признаков потенциально может быть более конкретно связан с одним или несколькими механизмами хозяин/паразит, регулирующими размножение варроа. В данном исследовании эти три возможные особенности были выявлены во всех исследованных популяциях, причем задержка была наиболее частой причиной неудачного размножения клещей. Во Франции доля отсутствия самцов была выше, чем во всех других исследованных популяциях, в то время как бесплодие было особенно низким в Молдове и Польше (Рисунок 6B). Пропорции трех признаков, формирующих ВСР, не меняются в зависимости от уровня ВСР колонии, что позволяет предположить, что все три признака могут быть важны для поддержания ВСР. История взаимодействия хозяина и паразита могла сформировать различные механизмы, наблюдаемые в данном исследовании. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы понять связь между особенностями размножения клещей и механизмом хозяин-паразит, который регулирует размножение клещей.

4.4. Сравнение ВСР с другими способами селекции на устойчивость к варроа

Значительный объем работы, связанный с оценкой SMR, и, как мы показали, значительный уровень вариабельности измерений, может поставить под сомнение преимущества этого признака по сравнению с другими признаками, которые, как известно, связаны с устойчивостью. Доступные в настоящее время анализы для оценки обнаружения и откупоривания расплода, паразитирующего на варроа, через поведение VSH в равной степени требуют много времени и являются более ограничительными, чем анализ SMR, с точки зрения требований к расплоду и клещам, а также демонстрируют высокий уровень изменчивости результатов [56]. Разработка биопробы, позволяющей изучать поведение пчел без необходимости заселения ячеек клещами, облегчила бы изучение признаков как SMR, так и VSH. Разработка молекулярных маркеров является большой надеждой в этом направлении, но, несмотря на несколько недавних находок [24], коммерческие услуги в настоящее время не доступны.

Преимущество фенотипа SMR в том, что он охватывает несколько возможных механизмов, ведущих к устойчивости, таких как действие взрослых пчел через VSH или нарушение размножения варроа расплодом. Альтернативным и даже более простым методом оценки устойчивости является наблюдение за ростом популяции варроа в колониях с течением времени. Это можно сделать с гораздо меньшими трудозатратами, чем подсчет VSH или SMR, и ожидается, что колонии с меньшим ростом в течение сезона выживут лучше, чем те, в которых клещей больше. Однако ценность этого подхода ограничена, поскольку многие факторы окружающей среды могут влиять на нагрузку варроа в колонии, например, приток клещей из соседних колоний [65], что, вероятно, объясняет низкую наследуемость роста популяции варроа [30,66].

Позволение природе проводить отбор с целью получения потомства из выживших колоний, иногда называемое методом Бонда [18] или дарвиновским пчеловодством [67], привлекло к себе внимание и приобрело некоторую привлекательность благодаря неоднократному обнаружению популяций, способных выживать без лечения [17,19,68]. Однако, как уже говорилось выше, до сих пор попытки внедрить таких медоносных пчел, выведенных в результате «естественного отбора», в пчеловодство в более широком масштабе не увенчались успехом.

5. Выводы

ВСР представляет собой сложный признак, поскольку он может быть вызван несколькими механизмами хозяина и/или паразита, на него влияет широкий спектр факторов окружающей среды, и остается сложным для точного фенотипирования в полевых условиях. В настоящем исследовании не удалось определить конкретный механизм, лежащий в основе признака SMR, и мы обнаружили большую неопределенность в его оценке при исследовании небольшого количества клеток. Тем не менее, SMR подразумевает более низкий рост популяции клещей и, таким образом, остается признаком, имеющим большое значение для разработки стратегий отбора для улучшения способности колоний медоносных пчел бороться с заражением одним из самых важных врагов медоносных пчел — клещом V. destructor.

Благодарности

Мы хотим поблагодарить всех технических специалистов за их кропотливую работу, наших коллег из RNSBB (исследовательская сеть по устойчивому разведению пчел) за ценные обсуждения и исследовательскую ассоциацию COLOSS за предоставление платформы для общения.

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы. Следующие материалы доступны онлайн на сайте https://www.mdpi.com/2075-4450/11/9/595/s1, Таблица S1: Результаты моделирования точности оценок ВСР.

Нажмите чтобы скачать файл

Авторский вклад

Концептуализация и методология, F.M., C.C., M.D.M., S.A., A.U., R.B.; эксперименты и получение данных, F.M., C.C., M.P., B.B., M.B., G.B., E.C., V.C., B.D., M.M.D., F.H., M.K., J.K., P.K., A.S.L., B.P., M.A.P., J.W., R.B.; анализ данных: S.A., F.M., B.S.; написание статьи: F.M., M.D.M., M.P., P.K., R.B. Все авторы прочитали и согласились с опубликованной версией рукописи.

Финансирование

Данное исследование не получало внешнего финансирования.

Конфликты интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Ссылки

1. Liu Z., Chen C., Niu Q., Qi W., Yuan C., Su S., Liu S., Zhang Y., Zhang X., Ji T., et al. Survey results of honey bee (Apis mellifera) colony losses in China (2010–2013) J. Apic. Res. 2016;55:29–37. doi: 10.1080/00218839.2016.1193375. 
[CrossRef] [Google Scholar]

2. Maggi M., Antúnez K., Invernizzi C., Aldea P., Vargas M., Negri P., Brasesco C., De Jong D., Message D., Teixeira E.W., et al. Honeybee health in South America. Apidologie. 2016;47:835–854. doi: 10.1007/s13592-016-0445-7. 
[CrossRef] [Google Scholar]

3. Morawetz L., Köglberger H., Griesbacher A., Derakhshifar I., Crailsheim K., Brodschneider R. Health status of honey bee colonies (Apis mellifera) and disease-related risk factors for colony losses in Austria. PLoS ONE. 2019;14:e0219293. doi: 10.1371/journal.pone.0219293.
[PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

4. Genersch E. Honey bee pathology: Current threats to honey bees and beekeeping. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2010;87:87–97. doi: 10.1007/s00253-010-2573-8. 
[PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

5. De Graaf D., Méroc E., Nguyen B.K., Roelandt S., Roels S., Van der Stede Y., Tonnersen T., Kryger P., Jaarma K., Kuus M., et al. Risk indicators affecting honeybee colony survival in Europe: One year of surveillance. Apidologie. 2016;47:348–378. doi: 10.1007/s13592-016-0440-z. 
[CrossRef] [Google Scholar]

6. Rosenkranz P., Aumeier P., Ziegelmann B. Biology and control of Varroa destructor. J. Invertebr. Pathol. 2010;103:S96–S119. doi: 10.1016/j.jip.2009.07.016. 
[PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

7. Le Conte Y., Ellis M., Ritter W. Varroa mites and honey bee health: Can Varroa explain part of the colony losses? Apidologie. 2010;41:353–363. doi: 10.1051/apido/2010017. 
[CrossRef] [Google Scholar]

8. Jacques A., Laurent M., Consortium E., Ribière-Chabert M., Saussac M., Bougeard S., Budge G.E., Hendrikx P., Chauzat M.-P. A pan-European epidemiological study reveals honey bee colony survival depends on beekeeper education and disease control. PLoS ONE. 2017;12:e0172591. doi: 10.1371/journal.pone.0172591. 
[PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

9. Milani N. The resistance of Varroa jacobsoni Oud. to acaricides. Apidologie. 1999;30:229–234. doi: 10.1051/apido:19990211. 
[CrossRef] [Google Scholar]

10. Milani N., Vedova G.D. Decline in the proportion of mites resistant to fluvalinate in a population of Varroa destructor not treated with pyrethroids. Apidologie. 2002;33:417–422. doi: 10.1051/apido:2002028. 
[CrossRef] [Google Scholar]

11. Elzen P.J., Westervelt D. Detection of coumaphos resistance in Varroa destructor in Florida. Am. Bee J. 2002;142:291–292. 
[Google Scholar]

12. González-Cabrera J., Bumann H., Rodríguez-Vargas S., Kennedy P.J., Krieger K., Altreuther G., Hertel A., Hertlein G., Nauen R., Williamson M.S. A single mutation is driving resistance to pyrethroids in European populations of the parasitic mite, Varroa destructor. J. Pest. Sci. 2018;91:1137–1144. doi: 10.1007/s10340-018-0968-y. 
[CrossRef] [Google Scholar]

13. Locke B., Forsgren E., Fries I., de Miranda J.R. Acaricide treatment affects viral dynamics in Varroa destructor-infested honey bee colonies via both host physiology and mite control. Appl. Environ. Microbiol. 2012;78:227–235. doi: 10.1128/AEM.06094-11. 
[PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

14. De Mattos I.M., Soares A.E., Tarpy D.R. Effects of synthetic acaricides on honey bee grooming behavior against the parasitic Varroa destructor mite. Apidologie. 2017;48:483–494. doi: 10.1007/s13592-017-0491-9. 
[CrossRef] [Google Scholar]

15. Bajuk B.P., Babnik K., Snoj T., Milčinski L., Ocepek M.P., Škof M., Jenčič V., Filazi A., Štajnbaher D., Kobal S. Coumaphos residues in honey, bee brood, and beeswax after Varroa treatment. Apidologie. 2017;48:588–598. doi: 10.1007/s13592-017-0501-y. 
[CrossRef] [Google Scholar]

16. Reybroeck W. Residues of antibiotics and chemotherapeutics in honey. J. Apic. Res. 2018;57:97–112. doi: 10.1080/00218839.2017.1338129. 
[CrossRef] [Google Scholar]

17. Le Conte Y., De Vaublanc G., Crauser D., Jeanne F., Rousselle J.-C., Bécard J.-M. Honey bee colonies that have survived Varroa destructor. Apidologie. 2007;38:566–572. doi: 10.1051/apido:2007040. 
[CrossRef] [Google Scholar]

18. Fries I., Imdorf A., Rosenkranz P. Survival of mite infested (Varroa destructor) honey bee (Apis mellifera) colonies in a Nordic climate. Apidologie. 2006;37:564–570. doi: 10.1051/apido:2006031. 
[CrossRef] [Google Scholar]

19. Seeley T.D. Honey bees of the Arnot Forest: A population of feral colonies persisting with Varroa destructor in the northeastern United States. Apidologie. 2007;38:19–29. doi: 10.1051/apido:2006055. 
[CrossRef] [Google Scholar]

20. Oddie M.A., Dahle B., Neumann P. Norwegian honey bees surviving Varroa destructor mite infestations by means of natural selection. PeerJ. 2017;5:e3956. doi: 10.7717/peerj.3956. 
[PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

21. Martin S.J., Hawkins G.P., Brettell L.E., Reece N., Correia-Oliveira M.E., Allsopp M.H. Varroa destructor reproduction and cell re-capping in mite-resistant Apis mellifera populations. Apidologie. 2019:1–13. doi: 10.1007/s13592-019-00721-9. 
[CrossRef] [Google Scholar]

22. Rinderer T.E., Harris J.W., Hunt G.J., De Guzman L.I. Breeding for resistance to Varroa destructor in North America. Apidologie. 2010;41:409–424. doi: 10.1051/apido/2010015. 
[CrossRef] [Google Scholar]

23. Büchler R., Berg S., Le Conte Y. Breeding for resistance to Varroa destructor in Europe. Apidologie. 2010;41:393–408. doi: 10.1051/apido/2010011. 
[CrossRef] [Google Scholar]

24. Mondet F., Beaurepaire A., McAfee A., Locke B., Alaux C., Blanchard S., Danka B., Le Conte Y. Honey bee survival mechanisms against the parasite Varroa destructor: A systematic review of phenotypic and genomic research efforts. Int. J. Parasitol. 2020;50:433–447. doi: 10.1016/j.ijpara.2020.03.005. 
[PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

25. Leclercq G., Pannebakker B., Gengler N., Nguyen B.K., Francis F. Drawbacks and benefits of hygienic behavior in honey bees (Apis mellifera L.): A review. J. Apic. Res. 2017;56:366–375. doi: 10.1080/00218839.2017.1327938. 
[CrossRef] [Google Scholar]

26. Horns F., Hood M.E. The evolution of disease resistance and tolerance in spatially structured populations. Ecol. Evol. 2012;2:1705–1711. doi: 10.1002/ece3.290. 
[PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

27. Locke B., Conte Y.L., Crauser D., Fries I. Host adaptations reduce the reproductive success of Varroa destructor in two distinct European honey bee populations. Ecol. Evol. 2012;2:1144–1150. doi: 10.1002/ece3.248. 
[PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

28. Locke B. Inheritance of reduced Varroa mite reproductive success in reciprocal crosses of mite-resistant and mite-susceptible honey bees (Apis mellifera) Apidologie. 2016;47:583–588. doi: 10.1007/s13592-015-0403-9. 
[CrossRef] [Google Scholar]

29. Harbo J.R., Harris J.W. Selecting honey bees for resistance to Varroa jacobsoni. Apidologie. 1999;30:183–196. doi: 10.1051/apido:19990208. 
[CrossRef] [Google Scholar]

30. Harbo J.R., Harris J.W. Heritability in Honey Bees (Hymenoptera: Apidae) of Characteristics Associated with Resistance to Varroa jacobsoni (Mesostigmata: Varroidae) J. Econ. Entomol. 1999;92:261–265. doi: 10.1093/jee/92.2.261. 
[CrossRef] [Google Scholar]

31. Danka R.G., Harris J.W., Dodds G.E. Selection of VSH-derived “Pol-line” honey bees and evaluation of their Varroa-resistance characteristics. Apidologie. 2016;47:483–490. doi: 10.1007/s13592-015-0413-7. 
[CrossRef] [Google Scholar]

32. Ibrahim A., Reuter G.S., Spivak M. Field trial of honey bee colonies bred for mechanisms of resistance against Varroa destructor. Apidologie. 2007;38:67–76. doi: 10.1051/apido:2006065. 
[CrossRef] [Google Scholar]

33. Ward K., Danka R., Ward R. Comparative performance of two mite-resistant stocks of honey bees (Hymenoptera: Apidae) in alabama beekeeping operations. J. Econ. Entomol. 2008;101:654–659. doi: 10.1093/jee/101.3.654. 
[PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

34. Harris J.W., Danka R.G., Villa J.D. Changes in infestation, cell cap condition, and reproductive status of Varroa destructor (Mesostigmata: Varroidae) in brood exposed to honey bees with Varroa sensitive hygiene. Ann. Entomol. Soc. Am. 2012;105:512–518. doi: 10.1603/AN11188. 
[CrossRef] [Google Scholar]

35. Oddie M., Büchler R., Dahle B., Kovacic M., Le Conte Y., Locke B., de Miranda J.R., Mondet F., Neumann P. Rapid parallel evolution overcomes global honey bee parasite. Sci. Rep. 2018;8:7704. doi: 10.1038/s41598-018-26001-7. 
[PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

36. Wagoner K.M., Spivak M., Rueppell O. Brood affects hygienic behavior in the honey bee (Hymenoptera: Apidae) J. Econ. Entomol. 2018;111:2520–2530. doi: 10.1093/jee/toy266. 
[PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

37. Conlon B.H., Frey E., Rosenkranz P., Locke B., Moritz R.F.A., Routtu J. The role of epistatic interactions underpinning resistance to parasitic Varroa mites in haploid honey bee (Apis mellifera) drones. J. Evol. Biol. 2018;31:801–809. doi: 10.1111/jeb.13271. 
[PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

38. Frey E., Odemer R., Blum T., Rosenkranz P. Activation and interruption of the reproduction of Varroa destructor is triggered by host signals (Apis mellifera) J. Invertebr. Pathol. 2013;113:56–62. doi: 10.1016/j.jip.2013.01.007. 
[PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

39. Techer M.A., Rane R.V., Grau M.L., Roberts J.M., Sullivan S.T., Liachko I., Childers A.K., Evans J.D., Mikheyev A.S. Divergent evolutionary trajectories following speciation in two ectoparasitic honey bee mites. Commun. Biol. 2019;2:1–16. doi: 10.1038/s42003-019-0606-0. 
[PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

40. Beaurepaire A., Sann C., Arredondo D., Mondet F., Le Conte Y. Behavioral Genetics of the Interactions between Apis mellifera and Varroa destructor. Insects. 2019;10:299. doi: 10.3390/insects10090299. 
[PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

41. Dietemann V., Nazzi F., Martin S.J., Anderson D.L., Locke B., Delaplane K.S., Wauquiez Q., Tannahill C., Frey E., Ziegelmann B., et al. Standard methods for Varroa research. J. Apic. Res. 2013;52:1–54. doi: 10.3896/IBRA.1.52.1.09. 
[CrossRef] [Google Scholar]

42. Büchler R., Costa C., Mondet F., Kezic N., Kovacic M. RNSBB SMR Recapping Protocol. [(accessed on 1 September 2020)]; Available online: www.beebreeding.net/wp-content/uploads/2017/11/RNSBB_SMR-recapping_protocol_2017_09_11.pdf

43. Danka R.G., Harris J.W., Villa J.D. Expression of Varroa Sensitive Hygiene (VSH) in commercial VSH honey bees (Hymenoptera: Apidae) J. Econ. Entomol. 2011;104:745–749. doi: 10.1603/EC10401. 
[PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

44. Villa J.D., Danka R.G., Harris J.W. Simplified methods of evaluating colonies for levels of Varroa Sensitive Hygiene (VSH) J. Apic. Res. 2009;48:162–167. doi: 10.3896/IBRA.1.48.3.03. 
[CrossRef] [Google Scholar]

45. De Vaublanc G., Otis G.W., Le Conte Y., Crauser D., Kelly P. Comparative resistance of Canadian and French colonies of honey bees (Apis mellifera) to Varroa destructor: Influence of bee strain, mite strain, and environment; Proceedings of the Annual North American Apicultural Research Symposium; Niagara Falls, ON, Canada. 5–6 December 2002. 
[Google Scholar]

46. Büchler R., Costa C., Hatjina F., Andonov S., Meixner M.D., Le Conte Y., Uzunov A., Berg S., Bienkowska M., Bouga M., et al. The influence of genetic origin and its interaction with environmental effects on the survival of Apis mellifera L. colonies in Europe. J. Apic. Res. 2014;53:205–214. doi: 10.3896/IBRA.1.53.2.03. 
[CrossRef] [Google Scholar]

47. Meixner M.D., Kryger P., Costa C. Effects of genotype, environment, and their interactions on honey bee health in Europe. Curr. Opin. Insect Sci. 2015;10:177–184. doi: 10.1016/j.cois.2015.05.010. 
[PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

48. Martin S., Holland K., Murray M. Non-reproduction in the honeybee mite Varroa jacobsoni. Exp. Appl. Acarol. 1997;21:539–549. doi: 10.1023/A:1018492231639. 
[CrossRef] [Google Scholar]

49. Locke B., Fries I. Characteristics of honey bee colonies (Apis mellifera) in Sweden surviving Varroa destructor infestation. Apidologie. 2011;42:533–542. doi: 10.1007/s13592-011-0029-5. 
[CrossRef] [Google Scholar]

50. Eguaras M., Marcangeli J., Fernandez N.A. Influence of ‘parasitic intensity’ on Varroa jacobsoni Oud. reproduction. J. Apic. Res. 1994;33:155–159. doi: 10.1080/00218839.1994.11100863. 
[CrossRef] [Google Scholar]

51. Büchler R. Varroa Tolerance in honey bees—Occurrence, characters and breeding. Bee World. 1994;75:54–70. doi: 10.1080/0005772X.1994.11099201. 
[CrossRef] [Google Scholar]

52. Schöning C., Gisder S., Geiselhardt S., Kretschmann I., Bienefeld K., Hilker M., Genersch E. Evidence for damage-dependent hygienic behaviour towards Varroa destructor-parasitised brood in the western honey bee, Apis mellifera. J. Exp. Biol. 2012;215:264–271. doi: 10.1242/jeb.062562. 
[PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

53. Momot J.P., Rothenbuhler W.C. Behaviour genetics of nest cleaning in honeybees. VI. Interactions of age and genotype of bees, and nectar flow. J. Apic. Res. 1971;10:11–21. doi: 10.1080/00218839.1971.11099665. 
[CrossRef] [Google Scholar]

54. Wielewski P., Arnaut de Toledo A.V., Martins E.N., Costa-Maia F.M., Faquinello P., Lino-Lourenço D.A., Ruvolo-Takasusuki M.C.C., Lopes de Oliveira C.A., Sereia M.J. Relationship between hygienic behavior and Varroa destructor mites in colonies producing honey or royal jelly. Sociobiology. 2012;59:251–274. doi: 10.13102/sociobiology.v59i1. 
[CrossRef] [Google Scholar]

55. Perrin J., Boukadiri A., Boyard P., Soubelet J.-B., Mazoit J.X. Hygienic behavior in honey bees and prediction of Varroa non-reproduction in single-drone inseminated (SDI) colonies. J. Apic. Res. 2020;59:185–192. doi: 10.1080/00218839.2019.1673550. 
[CrossRef] [Google Scholar]

56. Villa J.D., Danka R.G., Harris J.W. Repeatability of measurements of removal of mite-infested brood to assess Varroa Sensitive Hygiene. J. Apic. Res. 2017;56:631–634. doi: 10.1080/00218839.2017.1369707. 
[CrossRef] [Google Scholar]

57. Fries I., Camazine S., Sneyd J. Population Dynamics of Varroa jacobsoni: A Model and a Review. Bee World. 1994;75:5–28. doi: 10.1080/0005772X.1994.11099190. 
[CrossRef] [Google Scholar]

58. Guichard M., Neuditschko M., Fried P., Soland G., Dainat B. A future resistance breeding strategy against Varroa destructor in a small population of the dark honey bee. J. Apic. Res. 2019;58:814–823. doi: 10.1080/00218839.2019.1654966. 
[CrossRef] [Google Scholar]

59. Harris J.W., Harbo J.R. Changes in reproduction of Varroa destructor after honey bee queens were exchanged between resistant and susceptible colonies. Apidologie. 2000;31:689–699. doi: 10.1051/apido:2000153. 
[CrossRef] [Google Scholar]

60. Harbo J.R., Harris J.W. Responses to Varroa by honey bees with different levels of Varroa Sensitive Hygiene. J. Apic. Res. 2009;48:156–161. doi: 10.3896/IBRA.1.48.3.02. 
[CrossRef] [Google Scholar]

61. Harris J.W., Danka R.G., Villa J.D. Honey bees (Hymenoptera: Apidae) with the trait of Varroa Sensitive Hygiene remove brood with all reproductive stages of Varroa mites (Mesostigmata: Varroidae) Ann. Entomol. Soc. Am. 2010;103:146–152. doi: 10.1603/AN09138. 
[CrossRef] [Google Scholar]

62. Otten C. Reproduction and population dynamics of Varroa jacobsoni Oud. in colonies of Apis mellifera L. of different origins; Proceedings of the International Symposium of the International Federation of Beekeepers Associations; Gent, Belgium. 5–7 September 1990. 
[Google Scholar]

63. Gregorc A., Adamczyk J., Kapun S., Planinc I. Integrated Varroa control in honey bee (Apis mellifera carnica) colonies with or without brood. J. Apic. Res. 2016;55:253–258. doi: 10.1080/00218839.2016.1222700. 
[CrossRef] [Google Scholar]

64. Kovačić M. Ph.D. Thesis. Faculty of Agrobiotechnical Sciences, University of Osijek; Osijek, Croatia: 2018. Influence of Selection on Traits of Honey Bee (Apis mellifera carnica) in Croatia. 
[Google Scholar]

65. DeGrandi-Hoffman G., Ahumada F., Zazueta V., Chambers M., Hidalgo G., deJong E.W. Population growth of Varroa destructor (Acari: Varroidae) in honey bee colonies is affected by the number of foragers with mites. Exp. Appl. Acarol. 2016;69:21–34. doi: 10.1007/s10493-016-0022-9. 
[PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

66. Büchler R., Garrido C., Bienefeld K., Ehrhardt K. Selection for Varroa tolerance: Concept and results of a long-term selection project. Apidologie. 2008;39:598. 
[Google Scholar]

67. Blacquière T., Boot W., Calis J., Moro A., Neumann P., Panziera D. Darwinian black box selection for resistance to settled invasive Varroa destructor parasites in honey bees. Biol. Invasions. 2019;21:2519–2528. doi: 10.1007/s10530-019-02001-0. 
[CrossRef] [Google Scholar]

68. Locke B. Natural Varroa mite-surviving Apis mellifera honeybee populations. Apidologie. 2016;47:467–482. doi: 10.1007/s13592-015-0412-8. 
[CrossRef] [Google Scholar]