Перспективы гигиенического поведения у Apis mellifera и других социальных насекомых

Аннотация

Гигиеническое поведение у медоносных пчел, Apis mellifera, изучается уже более 80 лет с целью понимания механизмов устойчивости к патогенам и паразитам и здоровья колонии. Данный обзор посвящен поведенческим механизмам, лежащим в основе гигиенического поведения у медоносных пчел и, если известно, у других социальных насекомых. Мы исследуем связь между гигиеническим поведением медоносных пчел по отношению к больному расплоду и расплоду, паразитированному варроа (гигиена, чувствительная к варроа, VSH); время гигиенического удаления больного, зараженного варроа и вирусами расплода относительно риска передачи инфекции, которая может повлиять на жизнеспособность колонии; а также методы, полезность и одоранты, связанные с различными анализами, используемыми для отбора колоний на устойчивость к болезням и варроа. Мы также предлагаем направления для будущих исследований, которые принесут пользу здоровью и выживаемости медоносных пчел.

1 Введение

Гигиеническое поведение является важной формой социального иммунитета (Cremer et al. 2007) для ряда видов социальных насекомых. Термин «гигиеническое поведение» был введен Ротенбулером (1964) для описания процесса обнаружения и уничтожения больного расплода взрослыми медоносными пчелами (Apis mellifera). Термин «чувствительная к варроа гигиена» (ЧВГ) был введен совсем недавно (Harris 2007) для описания обнаружения и удаления расплода, зараженного паразитическим клещом Varroa destructor, медоносными пчелами (Harbo and Harris 2005). Поведенческая последовательность откупоривания и удаления расплода, впервые описанная (Rothenbuhler 1964), одинакова независимо от того, болен ли расплод, заражен клещом или мертв, но этот двигательный паттерн может быть вызван обнаружением различных запахов, связанных со статусом здоровья расплода. В колониях медоносных пчел уничтожение расплода заключается в том, что взрослые пчелы удаляют и/или каннибализируют аномальный расплод из отдельных ячеек, целым или по частям, и выбрасывают остатки за пределы улья; у термитов Reticulitermes — в каннибализации (Davis et al. 2018), а у муравьев Lasius — в деструктивной дезинфекции путем расчленения зараженной куколки и последующей дезинфекции ядом (Pull et al. 2018). Гигиеническое поведение помогает поддерживать здоровье густонаселенных сообществ насекомых, ограничивая горизонтальную передачу патогенов и рост популяции паразитов. Рабочие особи, уничтожающие уже зараженных или инфицированных особей, защищают колонию, или суперорганизм, подобно иммунным клеткам, которые защищают организм от распространения патогенов по всему телу (Cremer and Sixt 2009).

В последние годы исследования гигиенического поведения у медоносных пчел активизировались с целью понимания и восстановления здоровья колонии. Первые исследования такого поведения были связаны с устойчивостью медоносных пчел к американской плодожорке (вызываемой личинками Paenibacillus) и к меловой плодожорке (вызываемой Ascosphaera apis) (Spivak and Gilliam 1998a, b). В 1990-х годах внимание сместилось на связь между гигиеническим поведением и устойчивостью к паразитическому клещу варроа (Leclercq et al. 2018a; Mondet et al. 2020). В данном обзоре особое внимание уделяется поведенческим механизмам, лежащим в основе гигиенического поведения у медоносных пчел и, если известно, у других социальных насекомых. Целями данного обзора являются (1) изучение взаимосвязи между гигиеническим поведением медоносных пчел по отношению к больному расплоду и расплоду, паразитированному Varroa, и (2) создание направлений для будущих исследований, которые принесут пользу здоровью и выживаемости медоносных пчел.

2 Сроки гигиенического удаления больного расплода

В 1930-х годах самым серьезным заболеванием медоносных пчел была американская плодожорка. Пчеловоды и исследователи (Park 1937) отметили, что некоторые колонии не поддавались этой болезни, и они считали эти колонии устойчивыми. Они заметили, что «пчелы иногда удаляют и избавляются от личинок очень скоро после их смерти, таким образом устраняя улики». После этих наблюдений было установлено, что личинки первого возраста, полученные как из устойчивых, так и из восприимчивых колоний, были одинаково восприимчивы к американской плодожорке, но личинки, привитые более чем через 2 дня и 5 часов после вылупления из яйца, не заражались (Woodrow 1942). Позже было замечено, что взрослые пчелы из устойчивых колоний удаляли большую часть больного расплода из ячеек, тогда как пчелы из восприимчивых колоний этого не делали, и был сделан вывод, что устойчивость колонии зависит от поведенческого удаления больного расплода взрослыми пчелами, а не от физиологической устойчивости расплода (Woodrow and Holst 1942). Эти выводы были позже подтверждены Ротенбулером и другими (Spivak and Gilliam 1998a).

Эксперименты Вудроу и Холста также показали, что время удаления взрослыми пчелами зараженного расплода является ключом к пониманию кажущейся устойчивости (Woodrow and Holst 1942). После суспендирования известного количества спор P. larvae в пище, окружающей отдельных личинок первого возраста, они отметили, что устойчивые колонии начали удалять зараженных личинок на шестой день после инокуляции (день, когда ячейка, содержащая личинку 5-го возраста, закрывается воском) и удалили весь зараженный расплод к 11-му дню. Они собрали неповрежденный расплод, удаленный пчелами из улья, и обнаружили в нем только неинфекционную палочковидную форму личинок P., что указывает на то, что пчелы удаляли расплод из гнезда, пока в нем размножались неинфекционные палочки. В отличие от этого, пчелы в восприимчивой колонии начали удалять зараженный расплод только на 9-й день после инокуляции, и не весь больной расплод был удален из ячеек; часть расплода была удалена, но затем снова покрыта воском. Бактерия достигла стадии высокоинфекционной споры в оставшемся расплоде восприимчивых колоний, и пчелы из восприимчивых колоний иногда удаляли расплод, пока бактерии были инфекционными, потенциально распространяя болезнь. Вудроу и Холст пришли к выводу, что «…устойчивость колонии медоносных пчел к американской плодожорке заключается в способности обнаружить и удалить больной расплод до того, как возбудитель болезни… достигнет инфекционной стадии спор в больных личинках». Наблюдения за гигиенической активностью против расплода, зараженного Mellisococcus plutonius, побудили Дж. И. Хэмблтона сообщить, что «американские штаммы, устойчивые к фульбруду, очень восприимчивы к европейскому фульбруду» (Root 1966). Очевидная восприимчивость могла быть вызвана тем, что пчелы активно работали с молодыми личинками медоносных пчел, которые имеют инфекционные M. plutonius, но неинфекционные личинки P.; эта возможность требует дальнейшего изучения.

Своевременное обнаружение и удаление расплода было продемонстрировано после того, как пчелы были заражены другим патогеном — грибком мелбруда (Invernizzi et al. 2011). Наиболее гигиеничные колонии, те, которые откупоривали убитый булавками расплод (см. раздел «Анализы» ниже), также имели тенденцию откупоривать ячейки и каннибализировать зараженный меловым расплодом расплод до того, как расплод был поглощен грибковыми мицелиями и стал инфекционной «мумией». Колонии с многочисленными неповрежденными мумиями мелового расплода на нижней доске колонии указывали на то, что пчелы не соблюдали гигиену, поскольку зараженный расплод удалялся после того, как он достиг стадии спор, что увеличивало риск горизонтальной передачи инфекции.

Своевременное удаление зараженного расплода важно для других социальных насекомых, таких как колонии инвазивного садового муравья Lasius neglectus (Tragust et al. 2013; Pull et al. 2018) и подземного термита Reticulitermes flavipes (Davis et al. 2018). Эти колонии социальных насекомых гнездятся в почве, где они могут подвергаться воздействию почвенных грибковых энтомопатогенов, таких как Metarhizium. Взрослые муравьи рода Lasius собирают инфекционные конидиоспоры Metarhizium из расплода в инфрабуккальные мешочки и дезинфицируют грибковые гранулы в своих мешочках своим антимикробным ядом (Tragust et al. 2013). Если грибок остается незамеченным на кутикуле некоторых муравьев и прорастает в тело куколки, то при обнаружении зараженной куколки взрослые муравьи распаковывают ее из кокона, расчленяют и дезинфицируют остатки куколки ядом (Pull et al. 2018). Обнаружение и разрушительная дезинфекция зараженной куколки происходит, когда патоген находится в неинфекционном инкубационном периоде, подобно тому, как медоносные пчелы обнаруживают и удаляют из гнезда зараженных, но не инфекционных куколок. Деструктивная дезинфекция не позволяет патогену завершить свой жизненный цикл, тем самым предотвращая передачу заболевания внутри колонии (Pull et al. 2018). В колониях термитов R. flavipes конидиоспоры Metarhizium сметаются с зараженных особей, но как только грибок попадает в организм, термиты каннибализируют зараженного сородича (Davis et al. 2018). Не было установлено, происходит ли каннибализм во время неинфекционного инкубационного периода, однако переход от санитарной профилактики (алло-груминг) к уничтожению (каннибализм) был очевиден, что позволяет предположить, что термиты также способны определять стадию инфекции (Davis et al. 2018).

В целом, время обнаружения и уничтожения больного расплода взрослыми социальными насекомыми, по-видимому, является критическим компонентом в предотвращении передачи патогена в колониях этих социальных насекомых и, таким образом, в устойчивости на уровне колонии. Для патогена было бы выгодно, чтобы особи внутри колонии обрабатывали больной расплод, когда он заразен, поскольку это повышает риск передачи патогена, тогда как для колонии было бы выгодно, если бы особи уничтожали расплод до того, как он станет заразным, поскольку это ограничило бы распространение патогена. Вопрос о том, имеет ли аналогичное значение время уничтожения расплода при заражении клещами, обсуждается ниже.

3 Анализы гигиенического поведения медоносной пчелы

Биоанализы гигиенического поведения были недавно подробно рассмотрены (Leclercq et al. 2018a), поэтому здесь мы остановимся лишь на некоторых моментах. Лучший способ определить, может ли колония медоносных пчел (или других социальных насекомых) обнаружить и удалить больной расплод, — это заразить отдельных пчел или личинок, или всю колонию известной дозой патогена и наблюдать за реакцией взрослых сородичей на зараженных особей. Из-за рисков, связанных с заражением колоний медоносных пчел потенциально смертельными и высокоинфекционными патогенами, такими как P. larvae, исследователи начали изучать методы, которые не предполагают инокуляцию личинок патогеном. В качестве аналога больного расплода в колониях был представлен убитый цианидом расплод, чтобы облегчить эксперименты с использованием линий пчел, уже отобранных на устойчивость и восприимчивость к американской плодожорке (Jones and Rothenbuhler 1964). Позже исследователи начали проверять неселекционированные колонии на гигиеническое поведение с использованием расплода, убитого заморозкой (Spivak and Gilliam 1998b), или расплода, убитого булавками (Newton and Ostasiewski 1986).

То, насколько быстро колония могла обнаружить и удалить экспериментально убитый расплод, не всегда соответствовало способности колонии удалять больной расплод (Gilliam et al. 1983). Таким образом, после скрининга колоний с помощью анализа замороженного (или убитого булавкой) расплода важно впоследствии подвергнуть колонии воздействию патогена, чтобы определить, являются ли они поведенчески устойчивыми (Spivak and Reuter 2001a). В качестве недавнего примера, было обнаружено несовершенное соответствие между удалением убитого заморозками расплода и физиологической устойчивостью к меловому бруду в колониях австралийских медоносных пчел (Gerdts et al. 2018). Из 649 колоний, протестированных на гигиеническое поведение с помощью теста на убитый расплод, 16% были признаны высокогигиеничными (удалили 95% убитого расплода в течение 24 ч), что предполагает отсутствие признаков заболевания в колонии, но на самом деле в 23% этих высокогигиеничных колоний были обнаружены признаки заболевания мелкой плодожоркой. Эти результаты служат примером того, как анализ на замораживание расплода не полностью предсказывает поведенческую устойчивость в тестируемой популяции.

Следует отметить, что колонии, которые удаляют менее 95% убитого заморозкой расплода в течение 24 или 48 часов, как правило, удаляют мало, если вообще удаляют, зараженного патогеном расплода после заражения; они, как правило, не устойчивы к американской плодожорке или меловой плодожорке (M Spivak, неопубликованные данные). Это наблюдение заставляет задуматься о том, почему высокогигиеничные колонии редки в природе и существуют ли связанные с этим признаком издержки приспособленности (Spivak and Gilliam 1993; Mondragon et al. 2005; Bigio et al. 2014; Leclercq et al. 2017). Мы предполагаем, что устойчивость зависит не только от гигиенического поведения, но, вероятно, включает в себя комбинацию других физиологических факторов у медоносных пчел, включая иммунный ответ (Evans and Spivak 2010), трансгенерационный иммунный прайминг (Hernandez Lopez et al. 2014), сообщество микробиома (Raymann and Moran 2018), антимикробную активность личиночной пищи (Rose and Briggs 1969; Borba and Spivak 2017), наличие прополиса в гнезде (Borba et al. 2015) и другие факторы, которые еще предстоит обнаружить.

В целом, как указывалось ранее (Leclercq et al. 2018b), анализы гигиенического поведения, такие как анализы замороженного или убитого булавками расплода, не обязательно являются полезными предикторами устойчивости к патогенам в колонии или популяции колоний. Они полезны для скрининга колоний на способность взрослых пчел быстро удалять мертвый расплод (например, > 95% удаления в течение 24 часов для теста на замороженный расплод), и эти колонии могут быть впоследствии протестированы для количественной оценки устойчивости к патогенам. Другими словами, анализы используются для сужения круга колоний, подлежащих проверке, чтобы увеличить шансы найти устойчивые колонии.

4 Гигиеническое поведение по отношению к варроа

Хотя в некоторых колониях муравьев и термитов есть паразиты выводка (Korb and Fuchs 2006; Lachaud et al. 2016), исследования их гигиенической реакции ограничены; например, муравей Ecatomma tuberculatum обнаруживает и удаляет паразитических ос (Perez-Lachaud et al. 2015) и других нарушителей гнезда (Perez-Lachaud et al. 2019). Таким образом, в данном разделе мы сосредоточимся на реакции медоносных пчел на Varroa destructor. Когда V. destructor распространился по колониям A. mellifera в Европе и Северной Америке, исследователи обратились к исходному виду хозяев этого клеща, A. cerana, чтобы определить, как он выжил, не поддавшись паразиту. Был описан ряд потенциальных механизмов сопротивления (Boecking and Spivak 1999), одним из которых было гигиеническое поведение (Peng et al. 1987a; Peng et al. 1987b; Rath 1999). У Apis cerana варроа размножается только на сезонном трутневом расплоде и не размножается на рабочем расплоде. Если клещи заражают рабочий расплод (или экспериментально внедряются на рабочих куколок), куколки погибают под воздействием токсичного секрета слюнных желез, впрыскиваемого клещами (Zhang and Han 2018), и пчелы гигиенично удаляют мертвый расплод из гнезда (Page et al. 2016). Сигнал или сигнал от умирающей куколки был назван «альтруистическим самоубийством», а удаление — «социальным апоптозом»; предполагается, что эта комбинация увеличивает инклюзивные преимущества для колонии (Page et al. 2016). В A. mellifera варроа успешно размножается как на трутневом, так и на рабочем расплоде, и рабочие куколки не погибают при заражении клещами, хотя могут погибнуть, если также заражены достаточно высоким уровнем вируса (Martin 2001; de Miranda and Genersch 2010; Dainat et al. 2012).

После распространения варроа по Европе колонии A. m. carnica в Германии были проверены на способность обнаруживать и удалять зараженный варроа расплод (Boecking and Drescher 1992). Удаление зараженного расплода было бы формой устойчивости к клещам, поскольку это увеличило бы смертность клещей или нарушило бы их репродуктивный успех (Leclercq et al. 2018a). В исследовании Боэкинга и Дрешера (Boecking and Drescher 1992) колонии не были предварительно отобраны для гигиенического поведения или устойчивости к клещам. После экспериментального введения клещей в недавно закрытые выводковые клетки 29% зараженного расплода было удалено через 10 дней при введении одного клеща на клетку и 55% — при введении двух клещей на клетку, что указывает на то, что на самом деле некоторые колонии A. mellifera могут обнаружить и удалить некоторых зараженных клещами куколок, даже если они являются наивными хозяевами этого паразита.

Позже было исследовано, смогут ли колонии, отобранные по гигиеническому поведению на основе анализа замороженного расплода, обнаружить и удалить куколок, зараженных Варроа (Spivak 1996). Две линии пчел были заражены варроа, одна выведена в нескольких поколениях для быстрого гигиенического поведения (колонии, которые удаляли > 95% убитого расплода в течение 48 часов, Миннесотские гигиенические пчелы), а другая выведена для медленного гигиенического поведения (колонии, которые удаляли 20-30% убитого расплода в течение 48 часов). Таким образом, испытуемая популяция была скорее бимодальной, чем непрерывной в своей гигиенической реакции. В 3 из 4 лет быстрые или высокогигиеничные колонии удалили более 60% экспериментально зараженного клещами расплода к 10-му дню после того, как в недавно запечатанный расплод был внесен один клещ на клетку. Медленные или негигиеничные колонии удалили 10-20% зараженного расплода в те же годы (рис. 1).

В Великобритании была обнаружена значительная отрицательная связь между результатами анализа на убитый заморозкой расплод и ростом популяции клещей за один сезон (Toufailia et al. 2014). Статистическая значимость была обусловлена тем, что восемь из 42 колоний удалили > 95% убитого замораживанием расплода в течение 48 часов и, таким образом, были высокогигиеничными, что еще раз подтверждает, что скрининг таких высокогигиеничных колоний на основе анализа убитого замораживанием расплода поможет найти колонии с относительно более высоким потенциалом удаления зараженного клещами расплода. Колонии, которые удаляли менее 95% убитого замораживанием расплода, не показали значительной связи между гигиеническим поведением и ростом клещей (Toufailia et al. 2014), что также наблюдалось в Мексике (Mondragon et al. 2005).

Большая популяция, полученная из различных источников колоний в западной Канаде, была отобрана в течение трех поколений на гигиеническое поведение с использованием либо теста на замороженный расплод, либо пептидных биомаркеров из антенн пчел с целью проверки полезности отбора на гигиеническое поведение с помощью маркеров (Guarna et al. 2017). Одиннадцать из 13 белковых маркеров были связаны с гигиеническим поведением (в том числе два связаны с VSH, см. раздел ниже), а два были связаны с грумингом. Это замечательное исследование показало две вещи: белковые биомаркеры могут быть успешно использованы в разведении пчел (и, возможно, других животных), а также то, что по сравнению с неизбранным поголовьем, колонии, отобранные с использованием либо анализа на замороженный расплод, либо пептидных биомаркеров, отличались повышенным гигиеническим поведением, отсутствием потерь в производстве меда и повышенной выживаемостью при заражении личинками P. или Varroa.

Исследователи из Германии использовали анализ расплода, убитого булавками, в селекционных программах для успешного снижения нагрузки клещей. Другие исследователи сообщили об отсутствии корреляции между удалением замороженного или убитого булавками расплода и зараженностью колоний клещами, обзор которых приведен в Locke (2016). Однако в последних исследованиях эти анализы использовались для определения механизма устойчивости популяции, а не для отбора и сокращения числа колоний для последующего испытания с целью количественной оценки потенциальной устойчивости или использования в селекционных программах.

В целом, анализы на гигиеническое поведение расплода, убитого замораживанием и убитого булавками, являются полезными инструментами скрининга для поиска колоний, которые могут удалить больной и зараженный клещами расплод при последующем вызове. В частности, для варроа отбор пчел на основе этих анализов даст колонии с более низкой нагрузкой клещей по сравнению с колониями без отбора (Spivak and Reuter 1998; Spivak and Reuter 2001b; Büchler et al. 2010; Guarna et al. 2016; Guarna et al. 2017), но до сих пор отбор с помощью этих анализов не привел к популяциям, устойчивым к клещам, то есть популяциям, которые не требуют лечения для выживания. Таким образом, эти полевые анализы не должны использоваться в качестве единственных тестов или индикаторов устойчивости к варроа, поскольку другие признаки в разной степени способствуют этой устойчивости, обзор которых приведен в работе Mondet et al. (2020).

5 Гигиена, чувствительная к варроа

Чувствительная к варроа гигиена — это специализированный термин для обозначения гигиенического признака, при котором медоносные пчелы обнаруживают и удаляют расплод, специально зараженный варроа. Деятельность VSH во многом совпадает с гигиеническим признаком; пчелы выполняют гигиеническую поведенческую последовательность откупоривания и удаления расплода, но удаление в этом случае инициируется обнаружением зараженного клещами расплода, а не больного или мертвого расплода. Обратите внимание, что термин VSH также часто используется для обозначения линий пчел, выведенных для усиленного проявления признака. Пчелы, выражающие высокий уровень VSH, демонстрируют явную устойчивость к Варроа, поскольку им не требуется обработка, чтобы выжить после заражения клещами, как было продемонстрировано исследователями Министерства сельского хозяйства США в Батон-Руж, Лос-Анджелес, США. Следует отметить, что не был проведен критический эксперимент, который мог бы прояснить связь между колониями, отобранными по VSH, и колониями, отобранными по гигиеническому поведению, основанному на анализе расплода, убитого замораживанием или булавками. Было бы информативно проверить колонии, экспрессирующие VSH, с личинками P. larvae или патогеном A. apis, чтобы определить, реагируют ли пчелы, экспрессирующие VSH, только на зараженный клещами расплод, или они также обнаруживают и удаляют больной расплод и, таким образом, являются гигиеничными в целом.

История пчел с устойчивостью к клещам на основе VSH и их отбора на протяжении многих лет несколько запутана. Харбо и Хупингер начали с поиска колоний, проявляющих устойчивость к Варроа, без априорных предположений о том, какие признаки будут задействованы (Harbo and Hoopingarner 1997). Они инокулировали 43 колонии известным количеством варроа в начале сезона и определили количество клещей через ~ 10 недель. Они обнаружили три колонии с меньшим количеством клещей в конце теста, чем было первоначально инокулировано. Проведя ряд тестов для определения механизма активной устойчивости к клещам, они пришли к выводу, что фактором, который лучше всего объясняет очевидную устойчивость, является низкий репродуктивный успех клещей на рабочем расплоде. Они селективно вывели линию из нескольких колоний с самыми высокими показателями и дали ей название подавление размножения клещей или SMR. Механизм того, как пчелы или расплод из колоний SMR могли снизить репродуктивный успех клещей, был неизвестен. Клещи проникали в рабочие расплодные ячейки, чтобы питаться и размножаться; однако авторы сообщали, что клещи умирали в ячейке, не размножаясь, не производили потомства, производили только самцов или производили потомство слишком поздно для созревания (Harbo and Harris 1999).

Колонии SMR удалили > 95% убитого заморозкой расплода в течение 48 часов, что указывает на высокий уровень гигиенического поведения пчел (Ibrahim and Spivak 2006). Эти результаты были неожиданными, поскольку линия SMR была селекционирована для снижения размножения клещей, а не для гигиенического поведения (Harbo и Harris 1999). Была выдвинута гипотеза, что пчелы SMR могут обнаруживать и удалять куколок, на которых размножаются клещи, оставляя куколок с клещами, которые не размножаются успешно. Эта гипотеза была проверена двумя способами. В одном тесте недавно закрытые расплодные гребни с известным процентом заражения клещами были введены в колонии с признаком SMR и без него (Harbo и Harris 2005). Через 8 дней колонии с SMR имели значительно меньшую зараженность клещами (2%) по сравнению с контролем (9%). Из оставшихся клещей в колониях SMR было меньше репродуктивных клещей — 20% против 71%, что говорит о том, что пчелы SMR нацеливались на куколок с репродуктивными клещами. Во втором испытании клещи были экспериментально введены на отдельных куколок из двух типов колоний: SMR пчел и Миннесотских гигиенических пчел, которые были отобраны с помощью анализа замороженного расплода (Ibrahim and Spivak 2006). Колонии SMR удалили значительно больше зараженных клещом куколок, чем колонии из гигиенической линии. В совокупности эти результаты показали, что пчелы, выведенные для SMR, выражают гигиеническое поведение и что взрослые пчелы могут избирательно удалять куколок, зараженных репродуктивными клещами. Кроме того, гигиеническая активность может нарушить размножение клещей на куколках (Kirrane et al. 2011), и некоторые из этих клещей могут повторно заселить другие открытые расплодные ячейки и позже быть учтены как нерепродуктивные. В 2007 году Харрис переименовал линию из SMR в VSH, чтобы отразить, что основным механизмом, приводящим к нерепродуктивности клещей (и, следовательно, устойчивости к клещам), по-видимому, является гигиеническое поведение, а не способность выводка каким-то образом снижать репродуктивный успех клещей.

Еще одним результатом стало то, что репродуктивный успех (плодовитость и количество жизнеспособных самок потомства) варроа на куколках, не удаленных пчелами гигиеническим способом, был значительно ниже в колониях VSH, чем в колониях с гигиеническим поведением Миннесоты (Ibrahim and Spivak 2006). Это предполагает дополнительный эффект куколок VSH, который снижает репродуктивный успех клещей, указывая на то, что гигиеническое поведение само по себе не полностью отвечает за устойчивость к клещам в этой линии. Недавние исследования также предполагают эффект выводка, который подавляет размножение клещей (Wagoner et al. 2018; Wagoner et al. 2019). Такой эффект, исходящий от выводка, мог бы стать ценным признаком для поддержания устойчивости к клещу. Однако эффект, исходящий от выводка, не был достоверно увеличен при попытке отбора и селекции на него (Villa et al. 2016).

Методы, используемые для отбора устойчивых к варроа пчел исследователями USDA в Батон-Руж, менялись с течением времени. Первоначально прогресс был достигнут путем количественной оценки относительного роста популяции клещей за короткий период, обычно ~ 10 недель (Harbo и Hoopingarner 1997). Позднее колонии отбирались на основе частоты нерепродуктивных клещей в них, после того как было установлено, что этот фактор является главным определяющим фактором устойчивости (Harris and Harbo 2000). Частота нерепродуктивных клещей была наиболее широко используемым критерием отбора и продолжает использоваться сегодня. После того, как была обнаружена роль гигиены, некоторые методы отбора включали внесение гребней, содержащих известный процент зараженного клещами расплода, и количественную оценку снижения зараженности через 1 неделю (Villa et al. 2009). Этот метод требует большего числа повторений, чтобы быть точным, когда тестируемые колонии имеют низкую устойчивость к клещам (Villa et al. 2017). Опыт применения этих трех методов показывает, что в колониях с высокой устойчивостью к клещам (т.е. не требующих лечения против варроа) рост популяции клещей обычно составляет ≤ 1,0 за репродуктивный цикл (Harbo and Harris 2009) и ≥ 60% клещей, которые не репродуктивны, и удаляют ≥ 80% зараженного клещами расплода через 1 неделю (Danka et al. 2016).

Измерение роста популяции клещей, частоты нерепродуктивных клещей или удаления зараженного клещами расплода технически сложно и утомительно, и эти проблемы ограничивают селекцию пчеловодов на признак VSH. На сегодняшний день не существует простого полевого анализа, который позволил бы получить высокую устойчивость к варроа пчел, отобранных с помощью этих технических методов. Отбора на основе анализа замороженного расплода будет недостаточно (Danka et al. 2013) (и обсуждалось ранее). Некоторые устойчивые популяции, особенно «выжившие», которые процветают без лечения, показывают, что гигиеническое поведение, как бы оно ни оценивалось, может не быть основным механизмом для всех популяций, например, африканские популяции в Африке и неотропических странах, а также популяции в Швеции, Франции и Арнотском лесу в Нью-Йорке (Locke 2016; Mondet et al. 2020). Популяции высокоустойчивых пчел, включая выжившие популяции (Locke 2016) и русских пчел (Rinderer et al. 2001), демонстрируют отсутствие размножения клещей или низкий рост популяции клещей, но отсутствие или медленный рост популяции клещей может быть обусловлен сочетанием взаимосвязанных факторов, которые варьируются от особенностей жизненной истории (например, высокая частота роения) до отдельных поведенческих признаков (VSH или груминг).

6 Сроки удаления зараженного варроа и инфицированного вирусом расплода

Неизвестно, является ли время обнаружения и удаления зараженного варроа расплода столь же важным компонентом в предотвращении передачи паразитов, как и передача патогенов при удалении больного расплода. Этот вопрос не изучался. Время проведения гигиенических мероприятий может зависеть не от присутствия клеща как такового, а от уровня вирусов в куколках, таких как вирус деформации крыльев (DWV), который индуцируется клещами и переносится ими при питании клеща. Удаление пчелами зараженного клещами расплода обычно увеличивается через 72 часа после укупорки личинок воском (Spivak 1996; Harris 2007), когда личинка начинает метаморфозу в куколку и когда клещ питается и начинает размножаться в ячейке (Donzé and Guerin 1994; Martin 1995; Donzé and Guerin 1997). Процесс удаления может продолжаться в течение всего периода развития куколки (Vandame et al. 2002). Гигиеническая обработка зараженного вирусом расплода может либо увеличить, либо уменьшить передачу патогена. Риск увеличения передачи будет зависеть от типа и уровня вирусной инфекции, который может зависеть от стадии развития куколки пчел, а также от относительной инфекционности и вирулентности вируса для пчел. Эта область требует проверки, поскольку эти факторы только начинают изучаться у медоносных пчел (Brutscher et al. 2016; Grozinger and Flenniken 2019)

Несколько исследований показали связь между гигиеническим поведением и снижением количества зараженного вирусом расплода. Гигиенические колонии, определенные на основе анализа расплода, убитого булавкой, как правило, удаляли куколок рабочих, зараженных DWV (Schöning et al. 2012). В высокогигиеничных колониях, определенных на основе анализа расплода, убитого замораживанием, также наблюдался значительно более низкий уровень DWV в дополнение к более низкому росту популяции клещей в течение сезона (Toufailia et al. 2014). Выводок, зараженный DWV, выделяет химические соединения, которые при экспериментальном применении к выводку вызывают гигиеническое поведение (Wagoner et al. 2019). Соответствие между зараженностью клещами, вирусной нагрузкой и интенсивностью стимула не было изучено в отношении времени обнаружения и удаления гигиенического поведения медоносными пчелами. Понять взаимосвязь между этими факторами будет нелегко, и она не обязательно будет устойчивой от одной популяции пчел к другой, но она заслуживает изучения.

7 Механизмы обнаружения больного и зараженного варроа расплода взрослыми пчелами

Для изучения механизмов, лежащих в основе того, как взрослые медоносные пчелы обнаруживают больной расплод до того, как патоген достигнет стадии инфекционной споры, была выдвинута гипотеза, что гигиена опосредуется обонятельными стимулами, выделяемыми больным расплодом (Spivak et al. 2003). При этом было неизвестно, пассивно или активно выделяется одорант, то есть является ли он подсказкой или сигналом (Maynard Smith and Harper 2003; Leonhardt et al. 2016). Для проверки обонятельной гипотезы был использован ряд нейроэтологических методов с применением мелового расплода в качестве тест-патогена и линии медоносных пчел, селекционированных на гигиеническое поведение на основе реакции колонии на анализ замороженного расплода (Arathi et al. 2000; Masterman et al. 2000; Masterman et al. 2001; Gramacho and Spivak 2003; Spivak et al. 2003; Arathi et al. 2006; Swanson et al. 2009). На основании результатов этих экспериментов был сделан вывод, что пчелы из гигиенических колоний способны обнаруживать и различать запахи больного и здорового расплода при более низком уровне стимула по сравнению с пчелами из негигиенических колоний. Пчелы из негигиеничных колоний могли бы обнаружить и удалить больной расплод, но только тогда, когда патоген является инфекционным, а уровень стимула очень высок (Рисунок 2), что увеличивает риск передачи патогена.

Аналогичным образом, наблюдения ученых Министерства сельского хозяйства США выявили различные реакции на заражение варроа у пчел с гигиеной на основе VSH по сравнению с пчелами, не прошедшими гигиенический отбор. Пчелы без отбора, как правило, обнаруживали и удаляли мертвый или сильно больной расплод, но не живой, зараженный клещом расплод на одном и том же гребне. Однако, если подвергнуть тот же расплод воздействию пчел VSH, то это привело к гигиене против зараженного клещом расплода, который пчелы, не прошедшие отбор, проигнорировали (Рисунок 3). Этот пример иллюстрирует, как гигиеническая реакция на зараженный клещами расплод и зараженный болезнью расплод варьируется в зависимости от обонятельной чувствительности взрослых пчел.

Дополнительный подход к количественной оценке обонятельной чувствительности взрослых особей заключается в определении запахов, выделяемых расплодом, когда он мертв, болен или паразитирует. В ряде исследований предпринимались попытки определить соединения, выделяемые паразитирующим клещом расплодом, которые вызывают гигиеническое удаление расплода (Nazzi et al. 2004; Schöning et al. 2012; Mondet et al. 2016; Wagoner et al. 2019). На сегодняшний день результаты показывают, что может существовать множество соединений, связанных с зараженным варроа или болезнью расплодом, которые могут варьироваться в зависимости от генетического происхождения пчел (Wagoner et al. 2018) или экспериментальных методов, используемых различными исследователями (обзор в Mondet et al. (2020)).

Способность A. mellifera реагировать на живой, слегка поврежденный расплод наблюдается, когда куколки отклеиваются из-за заражения личинками восковой моли (Galleria или Achroia spp.). Эта активность предполагает, что поведенческая защита, которая предшествовала варроа, теперь используется в качестве основного инструмента социального иммунитета против клеща (Villegas and Villa 2006; Martin et al. 2019). Эта активность также примечательна тем, что, по-видимому, представляет собой ответ только на стимулы, производимые куколкой. Такие стимулы (а не стимулы от личинки восковой моли) предполагаются потому, что раскукливание происходит у куколок в узком возрастном диапазоне (обычно у тех, у кого белые, розовые или фиолетовые глаза). Эти куколки того же возраста, что и те, на которых направлена гигиена против Варроа, что позволяет предположить, что гигиена тесно связана с развитием куколок. Стимулы, инициированные реакцией слабо травмированного или «потревоженного» расплода, могут количественно и качественно отличаться от стимулов, полученных от мертвого или сильно травмированного или больного расплода. Эти последние стимулы могут быть связаны с более широкими гигиеническими реакциями, а не с более узконаправленной гигиеной, такой как VSH.

Известно, что социальные насекомые могут обнаруживать больной выводок, пока он не заразен, но неизвестно, является ли интенсивность стимула (подсказки или сигнала) низкой при обнаружении и устранении, а затем увеличивается по мере достижения инфекционной стадии. Соответствие между заболеваемостью и интенсивностью стимула было изучено у муравьев. У Lasius были обнаружены изменения в профилях кутикулярных углеводородов муравьев, зараженных грибковым патогеном Metarhizium (Pull et al. 2018). Зараженные куколки муравьев имели более высокое относительное содержание четырех кутикулярных углеводородов по сравнению с незараженными контрольными куколками, а зараженные куколки, которых распаковали взрослые особи, имели более высокое относительное содержание этих четырех и еще четырех кутикулярных углеводородов по сравнению с контрольными куколками, что позволяет предположить, что количество этих соединений может увеличиваться в течение инфекции. Соединения на поверхности муравьев представляли собой длинноцепочечные кутикулярные углеводороды (длина углеродной цепи C33-35) с низкой летучестью и химически отличались от соединений, которые вызывают у муравьев подгрызание или удаление трупов (Wilson et al. 1958). Два из четырех кутикулярных углеводородов, содержание которых было повышено на зараженных куколках, имели более высокую концентрацию на зараженных вирусом медоносных пчелах (Baracchi et al. 2012) и были похожи на соединения, обнаруженные Wagoner et al. (2018, 2019) на зараженных куколках медоносных пчел, которые были обнаружены и удалены пчелами-гигиенистами. Было высказано предположение, что эти соединения могут быть «консервативными сигналами болезни» у социальных насекомых, отобранными в течение эволюционного времени для повышения инклюзивной приспособленности заболевшей особи и повышения прямой приспособленности колонии (Pull et al. 2018).

Непроверенная гипотеза о роли запахов расплода, которую мы предлагаем, заключается в том, что взрослые медоносные пчелы могут иметь химический шаблон распознавания «здорового расплода» и, таким образом, способны обнаруживать многочисленные соединения, исходящие от любого «ненормального» расплода, будь то мертвый, больной или паразитирующий. Однако специфические запахи могут вызывать реакцию, которую можно дифференцировать на гигиеническую реакцию на патогены или клещей. Этот шаблон «здорового расплода» был бы аналогичен тому, как иммунная система определяет «свой» и «чужой» с помощью рецепторов распознавания образов (Medzhitov and Janeway 2002; Kawasaki and Kawai 2019) или как социальные насекомые распознают птенцов от нептенцов с помощью кутикулярных углеводородов (Perez-Lachaud et al. 2015; Leonhardt et al. 2016). Стимул от здорового расплода, вероятно, представляет собой смесь химических соединений, которые меняются в зависимости от возраста расплода (Le Conte et al. 1990; Le Conte and Hefetz 2008; Mondet et al. 2020). Взрослые пчелы из гигиеничных колоний, осматривая личинок и восковой расплод своими усиками, смогут обнаружить и отличить здоровый расплод от ненормального благодаря различным запахам расплода. Специфическая химическая природа одорантов аномального расплода может быть менее важна для пчел по сравнению с его относительным отличием от шаблона здорового расплода.

8 Повторная обработка

Колонии, очевидно устойчивые к варроа, демонстрируют высокую частоту повторного закрытия ячеек; то есть восковая крышечка над куколкой открывается, а затем снова закрывается воском (Boecking and Spivak 1999; Aumeier et al. 2000; Harris et al. 2012; Oddie et al. 2018; Martin et al. 2019). Повторное укупоривание пчелами становится очевидным, если экспериментально снять крышечку ячейки и осмотреть ее снизу; если она была повторно укупорена, то остается круглая область без шелковой прокладки. Было высказано предположение, что снятие и повторное закрытие ячеек расплода нарушает размножение клещей различными способами (Leclercq et al. 2018a). Откупоривание и переукупоривание было отмечено еще в ранних исследованиях устойчивости к американской плодожорке (Woodrow and Holst 1942), поэтому такое поведение не является специфическим для зараженного клещами расплода. Повторное укупоривание наблюдалось в связи с удалением убитого заморозками расплода (Spivak and Gilliam 1993), а процесс откупоривания и повторного укупоривания был интерпретирован как неэффективное разделение задач среди пчел с различными гигиеническими наклонностями (Arathi et al. 2006). Пчелы, которые откупоривали расплод, отличались от тех, кто его удалял: у тех, кто откупоривал, обонятельная чувствительность была выше, чем у тех, кто удалял (Gramacho and Spivak, 2003). Эти данные свидетельствуют о том, что некоторые пчелы могут обнаруживать раздражители от мертвого (больного или зараженного клещами) расплода и прогрызать отверстие в укупорке ячеек. Другие пчелы с более низкой обонятельной чувствительностью могут прогрызть ячейку, не обнаружив проблему внутри. С другой стороны, в некоторых колониях, где расплод кажется здоровым, наблюдается чрезмерное откупоривание ячеек; такая ситуация может указывать на дисфункцию между компонентами гигиены (рис. 4).

Последовательность поведения «откупоривание-откупоривание» требует дальнейшего изучения, особенно в связи с заражением клещами, где ее функция и полезность как индикатора гигиенического поведения или устойчивости к клещам все еще неясна (van Alphen and Fernhout 2019; Oddie et al. 2019). Вполне вероятно, что количество повторных укусов отражает взаимодействие между интенсивностью стимулов для расплода и обонятельной чувствительностью взрослых пчел в тестовых колониях, а также может включать различия в обонятельной чувствительности между патрилиниями внутри колоний.

9 Выводы

1
Анализы на гигиеническое поведение расплода, убитого заморозкой и булавкой, являются полезными скрининговыми инструментами для поиска колоний, которые могут удалить больной и зараженный клещами расплод при последующем испытании конкретным патогеном или варроа; однако эти полевые анализы не должны использоваться как единственные тесты или индикаторы устойчивости к патогену или варроа. Отбор с помощью этих тестов на гигиеническое поведение не привел к появлению популяций, устойчивых к клещам, то есть популяций, которым не требуется лечение для выживания.

2
Было бы полезно уточнить термины, например, когда гигиена, чувствительная к варроа (VSH), упоминается как признак по сравнению с выведенной линией пчел. Ссылка на VSH как на отдельный признак, отличный от гигиенического поведения (иногда сокращенно HYG), скорее запутывает, чем помогает, поскольку они включают в себя одну и ту же поведенческую последовательность обнаружения, откупоривания и удаления. Разница заключается в специфике: VSH относится к гигиеническому поведению, направленному на зараженный клещами расплод. Гигиеническое поведение — это более общий термин для удаления мертвого, больного (в том числе зараженного вирусами) и зараженного клещами расплода. Тем не менее, критическое испытание колоний, выведенных для VSH, патогеном для определения специфичности реакции не проводилось.

3
Необходимы исследования по срокам гигиенического удаления зараженного варроа и инфицированного вирусом расплода относительно риска дальнейшей передачи вируса. Необходима дополнительная работа по изучению потенциального соответствия между интенсивностью стимуляции расплода и уровнем инфицированности патогеном в отношении гигиенического обнаружения и удаления зараженного расплода. Если особи уничтожают расплод до того, как он станет заразным, это повышает приспособленность колонии, ограничивая передачу патогена; если же обрабатывать больной расплод, когда он заразен, это может снизить приспособленность колонии, в зависимости от инфекционности патогена и состояния здоровья колонии.

Ссылки

1.Arathi HS, Burns I, Spivak M (2000) Ethology of hygienic behaviour in the honey bee Apis mellifera L. (Hymenoptera: Apidae): Behavioural repertoire of hygienic bees. Ethology 106:365-379. https://doi.org/10.1046/j.1439-0310.2000.00556.xArticle Google Scholar 

2.Arathi HS, Ho G, Spivak M (2006) Inefficient task partitioning among nonhygienic honeybees, Apis mellifera L., and implications for disease transmission. Anim Behav 72:431-438. https://doi.org/10.1016/j.anbehav.2006.01.018Article Google Scholar 

3.Aumeier P, Rosenkranz P, Goncalves L (2000) A comparison of the hygienic response of Africanizied and European (Apis mellifera carnica) honey bees to Varroa—infested brood in tropical Brazil. Genet Molec Biol 23:787-791

4.Baracchi D, Mazza G, Turillazzi S (2012) From individual to collective immunity: the role of the venom as antimicrobial agent in the Stenogastrinae wasp societies. J Insect Physiol 58:188-193. https://doi.org/10.1016/j.jinsphys.2011.11.007Article CAS PubMed Google Scholar 

5.Bigio G, Al Toufailia H, Ratnieks FL (2014) Honey bee hygienic behaviour does not incur a cost via removal of healthy brood. J Evol Biol 27:226-230. https://doi.org/10.1111/jeb.12288Article CAS PubMed Google Scholar 

6.Boecking O, Drescher W (1992) The removal response of Apis mellifera L. colonies to brood in wax and plastic cells after artificial and natural infestation withVarroa jacobsoni Oud. and to freeze-killed brood. Exp & Appl Acarol 16:321-329. https://doi.org/10.1007/bf01218574Article Google Scholar 

7.Boecking O, Spivak M (1999) Behavioral defenses of honey bees against Varroa jacobsoni Oud. Apidologie 30:141-158. https://doi.org/10.1051/apido:19990205Article Google Scholar 

8.Borba RS, Klyczek KK, Mogen KL, Spivak M (2015) Seasonal benefits of a natural propolis envelope to honey bee immunity and colony health. J Exp Biol 218:3689-3699. https://doi.org/10.1242/jeb.127324Article PubMed Google Scholar 

9.Borba RS, Spivak M (2017) Propolis envelope in Apis mellifera colonies supports honey bees against the pathogen, Paenibacillus larvae. Sci Rep 7:11429. https://doi.org/10.1038/s41598-017-11689-w

10.Brutscher LM, McMenamin AJ, Flenniken ML (2016) The buzz about honey bee viruses. PLoS Pathog 12:e1005757. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1005757Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar 

11.Büchler R, Berg S, Le Conte Y (2010) Breeding for resistance to Varroa destructor in Europe. Apidologie 41:393-408. https://doi.org/10.1051/apido/2010011Article Google Scholar 

12.Cremer S, Armitage SA, Schmid-Hempel P (2007) Social immunity. Curr Biol 17:R693-702. https://doi.org/10.1016/j.cub.2007.06.008Article CAS PubMed Google Scholar 

13.Cremer S, Sixt M (2009) Analogies in the evolution of individual and social immunity. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 364:129-142. https://doi.org/10.1098/rstb.2008.0166Article PubMed Google Scholar 

14.Dainat B, Evans JD, Chen YP, Gauthier L, Neumann P (2012) Dead or alive: deformed wing virus and Varroa destructor reduce the life span of winter honeybees. Appl Environ Microbiol 78:981-987. https://doi.org/10.1128/AEM.06537-11Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar 

15.Danka RG, Harris JW, Dodds GE (2016) Selection of VSH-derived “Pol-line” honey bees and evaluation of their Varroa-resistance characteristics. Apidologie 47:483-490. https://doi.org/10.1007/s13592-015-0413-7Article Google Scholar 

16.Danka RG, Rinderer TE, Spivak M, Kefuss J (2013) Comments on: “Varroa destructor: research avenues towards sustainable control”. J Apicul Res 52:69-71. https://doi.org/10.3896/Ibra.1.52.2.14Article Google Scholar 

17.Davis HE, Meconcelli S, Radek R, McMahon DP (2018) Termites shape their collective behavioural response based on stage of infection. Sci Rep 8:14433. https://doi.org/10.1038/s41598-018-32721-7Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar 

18.de Miranda JR, Genersch E (2010) Deformed wing virus. J Invertebr Pathol 103 Suppl 1:S48-61. https://doi.org/10.1016/j.jip.2009.06.012Article CAS PubMed Google Scholar 

19.Donzé G, Guerin PM (1994) Behavioral attributes and parental care of Varroa mites parasitizing honeybee brood. Behav Ecol Sociobiol 34:305-319Article Google Scholar 

20.Donzé G, Guerin PM (1997) Time-activity budgets and space structuring by the different life stages of Varroa jacobsoni in capped brood of the honey bee, Apis mellifera. J Ins Behav10:371-393Article Google Scholar 

21.Evans JD, Spivak M (2010) Socialized medicine: individual and communal disease barriers in honey bees. J Invertebr Pathol 103 Suppl 1:S62-72. https://doi.org/10.1016/j.jip.2009.06.019Article PubMed Google Scholar 

22.Gerdts J, Dewar RL, Simone Finstrom M, Edwards T, Angove M (2018) Hygienic behaviour selection via freeze-killed honey bee brood not associated with chalkbrood resistance in eastern Australia PLoS One 13:e0203969. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0203969Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar 

23.Gilliam M, Taber S, Richardson GV (1983) Hygienic behavior of honey bees in relation to chalkbrood disease. Apidologie 14:29-39. https://doi.org/10.1051/apido:19830103Article Google Scholar 

24.Gramacho KP, Spivak M (2003) Differences in olfactory sensitivity and behavioral responses among honey bees bred for hygienic behavior. Behav Ecol Sociobiol 54:472-479. https://doi.org/10.1007/s00265-003-0643-yArticle Google Scholar 

25.Grozinger C, Flenniken ML (2019) Bee viruses: Ecology, pathogenicity, and impacts. Annu Rev Entomol 64:205-226. https://doi.org/10.1146/annurev-ento-Article CAS PubMed Google Scholar 

26.Guarna M et al. (2016) Expression biomarkers used for the selective breeding of complex polygenic traits. bioRxiv. https://doi.org/10.1101/076174

27.Guarna MM et al. (2017) Peptide biomarkers used for the selective breeding of a complex polygenic trait in honey bees. Sci Rep 7:8381. https://doi.org/10.1038/s41598-017-08464-2Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar 

28.Harbo JR, Harris JW (1999) Selecting honey bees for resistance to Varroa jacobsoni. Apidologie 30:183-196. https://doi.org/10.1051/apido:19990208

29.Harbo JR, Harris JW (2005) Suppressed mite reproduction explained by the behaviour of adult bees. J Apicul Res 44:21-23. https://doi.org/10.1080/00218839.2005.11101141Article Google Scholar 

30.Harbo JR, Harris JW (2009) Responses to Varroa by honey bees with different levels of Varroa Sensitive Hygiene. J Apicul Res 48:156-161. https://doi.org/10.3896/Ibra.1.48.3.02Article Google Scholar 

31.Harbo JR, Hoopingarner RA (1997) Honey Bees (Hymenoptera: Apidae) in the United States that express resistance to Varroa jacobsoni (Mesostigmata: Varroidae). J Econ Entomol 90:893-898Article Google Scholar 

32.Harris JW (2007) Bees with Varroa Sensitive Hygiene preferentially remove mite infested pupae aged five days post capping. J Apicul Res 46:134-139. https://doi.org/10.1080/00218839.2007.11101383

33.Harris JW, Danka RG, Villa JD (2012) Changes in infestation, cell cap condition, and reproductive status of Varroa destructor (Mesostigmata: Varroidae) in brood exposed to honey bees with Varroa sensitive hygiene. Ann Entomol Soc Amer 105:512-518. https://doi.org/10.1603/An11188Article Google Scholar 

34.Harris JW, Harbo JR (2000) Changes in reproduction of Varroa destructor after honey bee queens were exchanged between resistant and susceptible colonies. Apidologie 31:689-699Article Google Scholar 

35.Hernandez Lopez J, Schuehly W, Crailsheim K, Riessberger-Galle U (2014) Trans-generational immune priming in honeybees. Proc Biol Sci 281:20140454. https://doi.org/10.1098/rspb.2014.0454Article PubMed PubMed Central Google Scholar 

36.Ibrahim A, Spivak M (2006) The relationship between hygienic behavior and suppression of mite reproduction as honey bee (Apis mellifera) mechanisms of resistance to Varroa destructor. Apidologie 37:31-40. https://doi.org/10.1051/apido:2005052Article Google Scholar 

37.Invernizzi C, Rivas F, Bettucci L (2011) Resistance to chalkbrood disease in Apis mellifera L. (Hymenoptera: Apidae) colonies with different hygienic behavior. Neotropical Entomol 40:28-34Article CAS Google Scholar 

38.Jones RL, Rothenbuhler WC (1964) Behaviour genetics of nest cleaning in honey bees. II. Responses of two inbred lines to various amounts of cyanide-killed brood. Anim Behav12:584-588. https://doi.org/10.1016/0003-3472(64)90083-1Article Google Scholar 

39.Kawasaki T, Kawai T (2019) Discrimination between self and non-self-nucleic acids by the innate immune system. Int Rev Cell Mol Biol 344:1-30. https://doi.org/10.1016/bs.ircmb.2018.08.004Article CAS PubMed Google Scholar 

40.Kirrane MJ, De Guzman LI, Rinderer TE, Frake AM, Wagnitz J, Whelan PM (2011) Asynchronous development of honey bee host and Varroa destructor (Mesostigmata: Varroidae) influences reproductive potential of mites. J Econ Entomol 104:1146-1152. https://doi.org/10.1603/ec11035Article PubMed Google Scholar 

41.Korb J, Fuchs A (2006) Termites and mites – adaptive behavioural responses to infestation. Behaviour 143:891-907Article Google Scholar 

42.Lachaud JP, Klompen H, Perez-Lachaud G (2016) Macrodinychus mites as parasitoids of invasive ants: an overlooked parasitic association. Sci Rep 6:29995. https://doi.org/10.1038/srep29995Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar 

43.Le Conte Y, Arnold G, Trouiller J, Masson C, Chappe B (1990) Identification of a brood pheromone in honeybees. Naturwissenschaften 77:334-336. https://doi.org/10.1007/bf01138390Article Google Scholar 

44.Le Conte Y, Hefetz A (2008) Primer pheromones in social Hymenoptera. Annu Rev Entomol 53:523-542. https://doi.org/10.1146/annurev.ento.52.110405.091434Article CAS PubMed Google Scholar 

45.Leclercq G, Francis F, Gengler N, Blacquière T (2018a) Bioassays to quantify hygienic behavior in honey bee (Apis mellifera L.) colonies: A review. J Apicul Res 57:663-673. https://doi.org/10.1080/00218839.2018.1494916Article Google Scholar 

46.Leclercq G, Blacquière T, Gengler N, Francis F (2018b) Hygienic removal of freeze-killed brood does not predict Varroa-resistance traits in unselected stocks. J Apicul Res 57:292-299. https://doi.org/10.1080/00218839.2018.1426350Article Google Scholar 

47.Leclercq G, Pannebakker B, Gengler N, Nguyen BK, Francis F (2017) Drawbacks and benefits of hygienic behavior in honey bees (Apis mellifera L.): a review. J Apicul Res 56:366-375. https://doi.org/10.1080/00218839.2017.1327938Article Google Scholar 

48.Leonhardt SD, Menzel F, Nehring V, Schmitt T (2016) Ecology and evolution of communication in social insects. Cell 164:1277-1287. https://doi.org/10.1016/j.cell.2016.01.035Article CAS PubMed Google Scholar 

49.Locke B (2016) Natural Varroa mite-surviving Apis mellifera honeybee populations. Apidologie 47:467-482. https://doi.org/10.1007/s13592-015-0412-8Article Google Scholar 

50.Martin S (1995) Ontogenesis of the mite Varroa jacobsoni Oud. in drone brood of the honeybee Apis mellifera L. under natural conditions. Exp & Appl Acarology 19:199-210. https://doi.org/10.1007/BF00130823Article Google Scholar 

51.Martin SJ (2001) The role of Varroa and viral pathogens in the collapse of honeybee colonies. J Appl Ecol 38:1082-1093Article Google Scholar 

52.Martin SJ, Hawkins GP, Brettell LE, Reece N, Correia-Oliveira ME, Allsopp MH (2019) Varroa destructor reproduction and cell re-capping in mite-resistant Apis mellifera populations. Apidologie. https://doi.org/10.1007/s13592-019-00721-9Article Google Scholar 

53.Masterman R, Ross R, Mesce K, Spivak M (2001) Olfactory and behavioral response thresholds to odors of diseased brood differ between hygienic and non-hygienic honey bees (Apis mellifera L.). J Comp Phys A 187:441-452. https://doi.org/10.1007/s003590100216Article CAS Google Scholar 

54.Masterman R, Smith BH, Spivak M (2000) Brood odor discrimination abilities in hygienic honey bees (Apis mellifera L.) using proboscis extension reflex conditioning. J Ins Behav 13:87-101. https://doi.org/10.1023/A:1007767626594Article Google Scholar 

55.Maynard Smith J, Harper D (2003) Animal signals. Oxford series in ecology and evolution, 1st edn. Oxford University Press, New York Google Scholar 

56.Medzhitov R, Janeway CAJ (2002) Decoding the patterns of self and nonself by the innate immune system. Science 296:298-300 Article CAS Google Scholar 

57.Mondet F et al. (2020) Honey bee survival mechanisms against the parasite Varroa destructor: A systematic review of phenotypic and genomic research efforts. International J Parasitol 50:433-447. https://doi.org/10.1016/j.ijpara.2020.03.005

58.Mondet F, Kim SH, de Miranda JR, Beslay D, Le Conte Y, Mercer AR (2016) Specific cues associated with honey bee social defence against Varroa destructor infested brood. Sci Rep 6:25444. https://doi.org/10.1038/srep25444Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar 

59.Mondragon L, Spivak M, Vandame R (2005) A multifactorial study of the resistance of honeybees Apis mellifera to the mite Varroa destructor over one year in Mexico. Apidologie 36:345-358. https://doi.org/10.1051/apido:2005022Article Google Scholar 

60.Nazzi F, Della Vedova G, D’Agaro M (2004) A semiochemical from brood cells infested by Varroa destructor triggers hygienic behaviour in Apis mellifera. Apidologie 35:65-70. https://doi.org/10.1051/apido:2003065Article CAS Google Scholar 

61.Newton DC, Ostasiewski NJJ (1986) A simplified bioassay for behavioral resistance to American foulbrood in honey bees. Amer Bee J126:278-281Google Scholar 

62.Oddie M et al. (2018) Rapid parallel evolution overcomes global honey bee parasite. Sci Rep 8:7704. https://doi.org/10.1038/s41598-018-26001-7Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar 

63.Oddie M et al. (2019) Response to: A small shift in VSH-gene frequency instead of rapid parallel evolution in bees. A comment on Oddie et al. 2018. https://doi.org/10.13140/RG.2.2.14662.22085

64.Page P et al. (2016) Social apoptosis in honey bee superorganisms. Sci Rep 6:27210. https://doi.org/10.1038/srep27210Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar 

65.Park OW (1937) Testing for resistance to American foulbrood in honeybees. J Econ Entomol 30:504-512. https://doi.org/10.1093/jee/30.3.504Article Google Scholar 

66.Peng CS, Fang Y, Xu S, Ge L, Nasr ME (1987a) Response of foster Asian honeybee (Apis cerana Fabr.) colonies to the brood of European honeybee (Apis mellifera L.) infested with parasitic mite, Varroa jacobsoni Oudemans. J Invertebr Pathol 49:259-264Article Google Scholar 

67.Peng YS, Fang YZ, Xu SY, Ge LS (1987b) The resistance mechanism of the Asian honey bee, Apis cerana Fabr, to an ectoparasitic mite, Varroa jacobsoni Oudemans. J Invertebr Pathol 49:54-60. https://doi.org/10.1016/0022-2011(87)90125-XArticle Google Scholar 

68.Perez-Lachaud G, Bartolo-Reyes JC, Quiroa-Montalvan CM, Cruz-Lopez L, Lenoir A, Lachaud JP (2015) How to escape from the host nest: imperfect chemical mimicry in eucharitid parasitoids and exploitation of the ants’ hygienic behavior. J Insect Physiol 75:63-72. https://doi.org/10.1016/j.jinsphys.2015.03.003Article CAS PubMed Google Scholar 

69.Perez-Lachaud G, Rocha FH, Valle-Mora J, Henaut Y, Lachaud JP (2019) Fine-tuned intruder discrimination favors ant parasitoidism. PLoS One 14:e0210739. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0210739Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar 

70.Pull CD et al. (2018) Destructive disinfection of infected brood prevents systemic disease spread in ant colonies. Elife 7. https://doi.org/10.7554/eLife.32073

71.Rath W (1999) Co-adaptation of Apis cerana Fabr. and Varroa jacobsoni Oud Apidologie 30:97-110

72.Raymann K, Moran NA (2018) The role of the gut microbiome in health and disease of adult honey bee workers. Curr Opin Insect Sci 26:97-104. https://doi.org/10.1016/j.cois.2018.02.012Article PubMed PubMed Central Google Scholar 

73.Rinderer TE et al. (2001) Resistance to the parasitic mite Varroa destructor in honey bees from far-eastern Russia. Apidologie 32:381-394Article Google Scholar 

74.Root AI (1966) The ABC and XYZ of Bee Culture. 33rd Edition. 33th edition edn. The A. I. Root Co., Medina, Ohio

75.Rose R, Briggs JD (1969) Resistance to American foulbrood in honey bees IX. Effects of honey-bee larval food on the growth and viability of Bacillus larvae. J Invertebr Pathol 13:74-80Article Google Scholar 

76.Rothenbuhler WC (1964) Behaviour genetics of nest cleaning in honey bees. I. Responses of four inbred lines to disease-killed brood. Anim Behav12:578-583. https://doi.org/10.1016/0003-3472(64)90082-xArticle Google Scholar 

77.Schöning C, Gisder S, Geiselhardt S, Kretschmann I, Bienefeld K, Hilker M, Genersch E (2012) Evidence for damage-dependent hygienic behaviour towards Varroa destructor-parasitised brood in the western honey bee, Apis mellifera J Exp Biol 215:264-271. https://doi.org/10.1242/jeb.062562Article PubMed Google Scholar 

78.Spivak M (1996) Honey bee hygienic behavior and defense against Varroa jacobsoni. Apidologie 27:245-260. https://doi.org/10.1051/apido:19960407Article Google Scholar 

79.Spivak M, Gilliam M (1993) Facultative expression of hygienic behavior of honey bees in relation to disease resistance. J Apicul Res 32:147-157. https://doi.org/10.1080/00218839.1993.11101300Article Google Scholar 

80.Spivak M, Gilliam M (1998a) Hygienic behaviour of honey bees and its application for control of brood diseases and varroa Part I. Hygienic behaviour and resistance to American foulbrood. Bee World 79:124-134. https://doi.org/10.1080/0005772x.1998.11099394Article Google Scholar 

81.Spivak M, Gilliam M (1998b) Hygienic behaviour of honey bees and its application for control of brood diseases and varroa — Part II. Studies on hygienic behaviour since the Rothenbuhler era. Bee World 79:169-186. https://doi.org/10.1080/0005772x.1998.11099408Article Google Scholar 

82.Spivak M, Masterman R, Ross R, Mesce KA (2003) Hygienic behavior in the honey bee (Apis mellifera L.) and the modulatory role of octopamine. J Neurobiol 55:341-354. https://doi.org/10.1002/neu.10219Article CAS PubMed Google Scholar 

83.Spivak M, Reuter G (1998) Performance of hygienic honey bee colonies in a commercial apiary. Apidologie 29:291-302Article Google Scholar 

84.Spivak M, Reuter GS (2001a) Resistance to American foulbrood disease by honey bee colonies Apis mellifera bred for hygienic behavior. Apidologie 32:555-565Article Google Scholar 

85.Spivak M, Reuter GS (2001b) Varroa destructor infestation in untreated honey bee (Hymenoptera Apidae) colonies selected for hygienic behavior. J Econ Entomol 94:326-331Article CAS Google Scholar 

86.Swanson JA, Torto B, Kells SA, Mesce KA, Tumlinson JH, Spivak M (2009) Odorants that induce hygienic behavior in honeybees: identification of volatile compounds in chalkbrood-infected honeybee larvae. J Chem Ecol 35:1108-1116. https://doi.org/10.1007/s10886-009-9683-8Article CAS PubMed Google Scholar 

87.Toufailia HMA, Amiri E, Scandian L, Kryger P, Ratnieks FL (2014) Towards integrated control of varroa: effect of variation in hygienic behaviour among honey bee colonies on mite population increase and deformed wing virus incidence. J Apicul Res 53:555-562Article Google Scholar 

88.Tragust S, Mitteregger B, Barone V, Konrad M, Ugelvig LV, Cremer S (2013) Ants disinfect fungus-exposed brood by oral uptake and spread of their poison. Curr Biol 23:76-82. https://doi.org/10.1016/j.cub.2012.11.034Article CAS PubMed Google Scholar 

89.van Alphen JJM, Fernhout B (2019) A small shift in VSH-gene frequency instead of rapid parallel evolution in bees. A comment on Oddie et al. 2018 PeerJ Preprints 7. https://doi.org/10.7287/peerj.preprints.27938v2

90.Vandame R, Morand S, Colin M-E, Belzunces L (2002) Parasitism in the social bee Apis mellifera: Quantifying costs and benefits of behavioral resistance to Varroa destructor mites. Apidologie 33:443-445. https://doi.org/10.1051/apido:2002025Article Google Scholar 

91.Villa JD, Danka RG, Harris JW (2009) Simplified methods of evaluating colonies for levels of Varroa Sensitive Hygiene (VSH). J Apicul Res 48:162-167. https://doi.org/10.3896/Ibra.1.48.3.03Article Google Scholar 

92.Villa JD, Danka RG, Harris JW (2016) Selecting honeybees for worker brood that reduces the reproduction of Varroa destructor. Apidologie 47:771-778. https://doi.org/10.1007/s13592-016-0433-yArticle Google Scholar 

93.Villa JD, Danka RG, Harris JW (2017) Repeatability of measurements of removal of mite-infested brood to assess Varroa Sensitive Hygiene. J Apicul Res 56:631-634. https://doi.org/10.1080/00218839.2017.1369707Article Google Scholar 

94.Villegas AJ, Villa JD (2006) Uncapping of pupal cells by European bees in the United States as responses to Varroa destructor and Galleria mellonella. J Apicul Res 45:203-206. https://doi.org/10.1080/00218839.2006.11101348Article Google Scholar 

95.Wagoner K, Spivak M, Hefetz A, Reams T, Rueppell O (2019) Stock-specific chemical brood signals are induced by Varroa and Deformed Wing Virus, and elicit hygienic response in the honey bee. Sci Rep 9:8753. https://doi.org/10.1038/s41598-019-45008-2Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar 

96.Wagoner KM, Spivak M, Rueppell O (2018) Brood affects hygienic behavior in the honey bee (Hymenoptera: Apidae). J Econ Entomol 111:2520-2530. https://doi.org/10.1093/jee/toy266Article CAS PubMed Google Scholar 

97.Wilson EO, Durlach NI, Roth LM (1958) Chemical releasers of necrophoric behavior in ants. Psyche 65:108-114Article Google Scholar 

98.Woodrow AW (1942) Susceptibility of honeybee larvae to individual inoculations with spores of Bacillus larvae. J Econ Entomol 35:892-895. https://doi.org/10.1093/jee/35.6.892Article Google Scholar 

99.Woodrow A, Holst E (1942) Removal of diseased brood in colonies infected with American foulbrood. Am Bee J 83:22-23Google Scholar 

100.Zhang Y, Han R (2018) A saliva protein of Varroa mites contributes to the toxicity toward Apis cerana and the DWV elevation in A. mellifera. Sci Rep 8:3387. https://doi.org/10.1038/s41598-018-21736-9