Разгадка пчелиного клея: Новое понимание источников и факторов, определяющих потребление смолы медоносными пчелами (Apis mellifera)

Аннотация

Медоносные пчелы (Apis mellifera) находятся под угрозой многочисленных патогенов и паразитов. Для предотвращения инфекций они применяют кооперативные поведенческие средства защиты, такие как алло-груминг и гигиена, или используют антимикробную растительную смолу. Смола — это химически сложная и очень изменчивая смесь многих биологически активных соединений. Пчелы собирают липкий материал с различных видов растений и используют его для строительства и защиты гнезда. Несмотря на ее важность для здоровья колонии, сравнительно мало известно о точном происхождении и изменчивости спектров смолы, собираемой медоносными пчелами. Чтобы определить ботанические источники смолы A. mellifera в Западной Европе, мы провели химическое сравнение смолы отдельных фуражиров и смолы деревьев. Далее мы изучили потребление смолы 25 колониями из пяти различных пасек, чтобы оценить влияние местоположения на вариации в спектрах собранной смолы. Во всех колониях и пасеках было выделено семь различных типов смолы в соответствии с их цветом и химическим составом. Совпадения между собранной пчелами смолой и смолой деревьев показали, что пчелы используют тополь (Populus balsamifera, P. x canadensis), березу (Betula alba), конский каштан (Aesculus hippocastanum) и хвойные деревья (либо Picea abies, либо Pinus sylvestris) в качестве источников смолы. Наши данные показывают, что медоносные пчелы собирают сравнительно широкий и разнообразный спектр источников смолы, обеспечивая тем самым защиту от множества антагонистов, чувствительных к различным смолам и/или соединениям. Мы также выявили предпочтения к определенным смолам и хемотипам смол, что указывает на то, что медоносные пчелы избирательно ищут биологически активные соединения смол.

Введение

Медоносные пчелы (Apis mellifera) подвергаются угрозе со стороны многочисленных вредителей и патогенов [1—3]. Кроме того, им приходится иметь дело с многочисленными экологическими стрессорами, вызванными интенсификацией сельского хозяйства, такими как пестициды, изменение кормовых ландшафтов, снижение разнообразия ресурсов и быстрое распространение новых вредителей и патогенов [4—9]. Воздействие отдельных или комбинированных стрессоров может иметь разрушительные последствия для здоровья медоносных пчел и даже привести к полному краху колоний, как это наблюдается, например, при больших зимних потерях в Европе и Северной Америке [10]. Для повышения жизнестойкости колоний, вместо того чтобы устранять только симптомы, устойчивой стратегией является содействие естественным защитным силам пчел [11—14]. Медоносные пчелы выполняют несколько совместных действий, таких как алло-груминг, гигиена гнезда или сбор и использование противомикробных растительных смол, которые называются социальным или внешним иммунитетом и играют важную роль для здоровья колонии [15—18]. В то время как гигиеническому поведению уделяется много внимания, использование и роль растительных смол до недавнего времени оставались без внимания [19,20].

Растительная смола — это липкое, нерастворимое в воде вещество, которое растения выделяют в основном для защиты поврежденных тканей, молодых ростков или листовых почек от нападения травоядных и/или патогенов [21]. Смола представляет собой химически сложную смесь из более чем 300 веществ (в основном фенольных соединений, таких как флавоноиды, ароматические карбоновые кислоты, бензопираны и терпеноиды), многие из которых проявляют антимикробные и/или репеллентные свойства [21]. Химический состав смолы обычно зависит от вида растения, но может сильно варьироваться — как качественно, так и количественно — внутри семейств растений и между ними, и даже между близкородственными видами растений [21].

Apis mellifera, а также некоторые тропические беззубые пчелы (Apidae: Meliponini) используют смолу для строительства гнезд и для защиты от вредителей и патогенов [19,22—24]. Смолу часто смешивают с различными количествами воска, в результате чего получается жесткое, липкое вещество, которое называют прополисом или пчелиным клеем [25]. Неуправляемые, одичавшие колонии медоносных пчел покрывают все внутреннее пространство гнезда тонким слоем прополиса, называемым «прополисной оболочкой» [26]. Такая «прополисная оболочка» может уменьшить нагрузку микробов и снизить экспрессию (по крайней мере, двух) генов, связанных с иммунитетом [19]. Более того, несколько исследований показали, что прополис снижает рост важных микробов-патогенов пчел, например, Paenibacillus larvae, возбудителя американской плодожорки [27—29], и Ascophaera apis, грибкового паразита, вызывающего меловую плодожорку [28,30]. Смола/прополис дополнительно усиливали иммунную активность отдельных пчел, что позволяло им более эффективно бороться с патогенными вызовами [19,31—34]. Следовательно, смола играет решающую роль для здоровья колонии и представляет собой важный ресурс для медоносных пчел.

Несмотря на ее очевидную важность, мы все еще относительно мало знаем о сборе смолы у медоносных пчел. Хотя было показано, что тропические пчелы собирают смолу с широкого спектра видов растений [23,35], точная информация о растительных источниках, используемых Apis mellifera, все еще скудна и в основном ограничена спорадическими наблюдениями (например, фуражиров на гибридных Populus spp, Франция [36] и хвойных деревьях, Северная Америка [37]), немногочисленными химическими сравнениями (например, для Baccharis dracunculifolia, Бразилия [38], и Populus deltoides, P. balsamifera и гибридных Populus spp., Северная Америка [39,40]) и выводами из основных химических соединений прополиса [41—43]. Однако прополис обычно производится путем смешивания различных смол (и воска), что затрудняет выводы о единственном оригинальном источнике смолы или о вариациях между различными источниками смолы, поскольку некоторые соединения (например, камфен, альфа- и бета-пинен, лимонен и мирцен) встречаются в смолах многочисленных растительных таксонов [21]. Более того, идентификация ботанических источников на основе наблюдений является сложной задачей, поскольку фактический процесс фуражировки трудно наблюдать, так как он обычно осуществляется относительно небольшим количеством пчел [30] и может происходить высоко на деревьях [44].

На основании перечисленных выше исследований, виды тополя (гибрид Populus spp.), конского каштана (Aesculus hippocastanum), ольхи (Alnus spp.), березы (Betula spp.), ивы (Salix spp.) и некоторые другие в настоящее время считаются основными источниками смолы для медоносных пчел в регионах с умеренным климатом [25,43,45]. Однако большинство видов растений еще не подтверждены в качестве фактического источника смолы путем тщательного химического сравнения (но см. [39]), и информация о возможных предпочтениях, а также об изменении сбора различных источников смолы в пространстве и времени в значительной степени отсутствует.

Такая информация может быть получена только путем отслеживания поведения отдельных сборщиков смолы, например, путем сбора и химического анализа смолы с задних ног возвращающихся сборщиков. Насколько нам известно, в Северной Америке есть только два исследования, в которых химически анализировались грузы отдельных собирателей смолы [39,40]. Однако оба исследования изучали сбор смолы пчелами только на одной пасеке/ участке и поэтому не дают информации о вариациях между участками и во времени.

В продолжение первых результатов работы [39] наше исследование было направлено на определение ботанических источников смолы, собранной Apis mellifera в Западной Европе, путем сравнительного химического анализа на уровне отдельных сборщиков. Далее мы изучили потребление смолы 28 различными колониями из семи различных пасек, размещенных в местах, отличающихся структурой окружающего ландшафта и, таким образом, составом и/или относительной численностью древесных пород, чтобы оценить влияние местоположения на вариации в спектрах собранной смолы.

Материал и методы

Места исследования и колонии медоносных пчел

Наблюдения за поведением пчел при сборе смолы и отбор проб смолы с пчел и деревьев проводились на семи различных участках в Нижней Саксонии, на северо-западе Германии, в период с июня по октябрь 2012/2013 года. Расстояния между всеми участками варьировали от минимального 1,3 км до максимального 38 км, а для участков, включенных в анализ различий между участками, от 4,6 км до 29,5 км, соответственно (S1 рис.). Среда обитания вокруг пасек характеризовалась либо сельскохозяйственным ландшафтом с пашнями (с преобладанием кукурузы, рапса и картофеля), пастбищами и смешанными лесами (N = 5 участков), либо городским ландшафтом с парками, небольшими садами или участками и придорожными деревьями (N = 2 участка; Таблица 1). В целом, в этом регионе преобладает континентальный климат с типичными лесными массивами, состоящими из дуба (Quercus robur /petraea), бука (Fagus sylvatica), сосны (Pinus sylvestris) и ели (Picea abies). Другие часто встречающиеся лиственные породы деревьев относятся к родам береза (Betula), тополь (Populus), ольха (Alnus), клен (Acer), ясень (Fraxinus) и липа (Tilia). Таким образом, наш регион исследования включал несколько видов деревьев, которые предположительно являются источниками смолы для Apis mellifera, т.е. Betula spp., Aesculus hippocastanum, Alnus spp. и несколько видов в роде Populus (т.е. несколько неизвестных гибридов P. xcanadensi из секции Aigeiros, P. balsamifera из секции Tacamahaca и P. tremula из секции Populus). Особи всех видов были доступны в радиусе полета каждой пасеки, за исключением P. balsamifera, которая встречалась только на двух участках, и A. hippocastanum, который отсутствовал на одном участке.

Все владельцы земли и пчеловоды дали разрешение на отбор проб, где это было необходимо. Образцы смолы деревьев были получены с деревьев, расположенных на общественных участках, где не требовалось специального разрешения.

Наблюдение за потреблением смолы

Потребление смолы 28 колониями A. mellifera из семи различных пасек наблюдалось путем вскрытия каждой колонии пчел и поиска фуражиров смолы на верхней части рамок в течение 15 минут. Поскольку разгрузка груза смолы часто происходит на верхней части рамок с помощью одной или двух других пчел (личное наблюдение), здесь сборщики смолы могут быть легко идентифицированы и пойманы. Различные смолы, собранные пчелами, были классифицированы по цвету [46], в результате чего было выделено семь типов цвета смолы: «оранжевый», «красный», «охра», «зелено-коричневый», «светло-прозрачный», «желтый» и «беловатый» (все они также включают разновидности соответствующего цвета, например, светло-охристый или темно-оранжевый, см. рис. 1). Категории затем подтверждались химически (см. ниже). Данные всех 28 колоний были использованы для того, чтобы охватить весь спектр смол, собираемых пчелами в районе исследования. Все типы цвета смолы были отобраны для химического анализа, как описано ниже. Чтобы избежать многократного учета одной и той же особи пчел, сборщиков смолы либо держали в пластиковых трубках до конца наблюдений, либо брали их смолу, прежде чем выпустить на волю. Колонии наблюдали от трех до восьми раз (16 колоний) или, из-за нехватки времени, только один-два раза (12 колоний).

Чтобы оценить специфические для конкретного места различия в спектрах и разнообразии смол, собираемых колониями, мы дополнительно регистрировали количество возвращающихся сборщиков смолы, несущих определенный тип цвета, в течение 15-минутных интервалов времени. Анализ специфических различий был ограничен колониями, которые наблюдались в три или более разных дня (Таблица 1). Каждая из этих 16 колоний наблюдалась в 6 ± 3 (среднее ± стандартное отклонение (SD)) дня между 12 и 18 часами дня (Таблица 1). Наконец, для оценки возможного влияния на потребление смолы в каждом интервале наблюдения регистрировалась температура.

Идентификация источников смолы — отбор образцов пчел и деревьев

Чтобы определить растительные источники смолы, собранной пчелами, мы сравнили химический состав смолы, собранной отдельными пчелами, со смолой, собранной с местных видов деревьев. Образцы смолы отбирали у возвращающихся фуражиров, отлавливая их в пластиковую трубку с прикрепленной с одной стороны сеткой (как обычно используется для маркировки пчелиных маток) и осторожно снимая смолу с мозолей их задних ног с помощью пинцета. Смолу деревьев собирали с отдельных деревьев в ближайшем окружении (приблизительно 0,5-2 км) наших исследовательских пасек путем осторожного соскабливания естественных смоляных выделений с почек или, в случае Picea abis и Pinus sylvestris, со свежих ранок. Образцы трех почек или нескольких побегов объединялись для каждого дерева, и, по возможности, отбирались и анализировались как минимум три особи каждого вида деревьев, чтобы учесть различия между особями. Мы собрали смолы с восьми различных видов деревьев: Aesculus hippocastanum (3 образца/дерево), Alnus glutinosa (3), Betula alba (4), Populus balsamifera (1), Populus tremula (3), Populus x canadensis (9), Picea abis (2) и Pinus sylvestris (3). В целом, 37 образцов пчел и 28 образцов деревьев были собраны на семи различных пасеках, чтобы учесть возможные различия между участками. Все образцы (пчел и деревьев) были немедленно погружены в гексан и охлаждены (-18 C°) до химического анализа. Мы дополнительно взяли образцы прополиса из двух отдельных колоний на каждом участке. Прополис получали, помещая коммерческие пластиковые решетки поверх рамок с июня по сентябрь, и собирали один раз в сентябре. Для химического анализа 0,3 г измельченного прополиса из каждой решетки экстрагировали в гексане.

Химический анализ

Гексановые экстракты образцов прополиса и смолы анализировали методом газовой хроматографии, соединенной с масс-спектрометрией (ГХ-МС), используя газохроматографическую систему Hewlett Packard HP 6890 Series, соединенную с масс-селективным детектором Hewlett Packard HP 5973 (Agilent Technologies, Бёблинген, Германия) и ГХ/МС Shimadzu QP2010 Ultra (Shimadzu, Дуйсбург, Германия). Следующие образцы смолы деревьев, т.е. POL1 (тополь Px2), POL2 (тополь Px2), LG109 (ель) и смолы, собранные пчелами: LG111 (ель), OL126 (оранжевая), BB204 (беловатая), OL131 (ольха), OL128 (оранжевая), BB206 (коричневая), были проанализированы с помощью масс-селективного детектора Hewlett Packard HP 5973 (Agilent Technologies, Бёблинген, Германия), в то время как все остальные образцы были проанализированы с помощью Shimadzu QP2010 Ultra GC/MS (Shimadzu, Дуйсбург, Германия). ГХ были оснащены капиллярной колонкой J & W, DB-5 из плавленого кремнезема (30 м×0,25 мм ID; df = 0,25 мкм; J & W, Folsom, CA, США). Температура программировалась от 60°C до 300°C со скоростью нагрева 5°C/мин и выдерживалась при 300°C в течение 10 мин. В качестве газа-носителя использовался гелий с постоянным расходом 1 мл/мин. Инжекцию проводили при 250°C в режиме без разделения в течение 1 мин. Масс-спектры электронного удара (EI-MS) регистрировали при напряжении ионизации 70 эВ и температуре источника 230°C. Для сбора данных использовали Windows-версию программного пакета ChemStation (Agilent Technologies, Бёблинген, Германия) и программу GCMSsolution Vers. 2.7 для сбора данных. Хроматограммы образцов анализировали вручную, характеризуя каждый пик хроматограммы и сравнивая их по образцам/хроматограммам. Пики характеризовались временем удерживания и масс-спектрами. Для сопоставления пиков различных хроматограмм использовалась персональная библиотека, в которой пики с одинаковым временем удерживания и масс-спектром считались одинаковыми веществами (включая идентифицированные и неидентифицированные вещества). Затем мы рассчитали относительные площади пиков для каждого соединения путем деления интегральной площади каждого пика на общую площадь всех пиков. Для подтверждения идентификации и расчета индексов Коватса мы дополнительно проводили анализ синтетических алканов (Sigma-Aldrich, Мюнхен, Германия). Для окончательной идентификации различных классов веществ и, по возможности, веществ, мы использовали три коммерчески доступные библиотеки масс-спектров (Wiley 275, NIST 98 и Adams EO library 2205) и диагностические ионы и индексы Коватса для проверки нашей характеристики.

Статистический анализ

Для анализа влияния окружающей среды обитания (эффект места) на спектр смолы, собранной отдельными колониями, мы провели тесты перестановки, основанные на относительных частотах различных типов цвета смолы (команда Adonis, пакет R vegan [47]). Различия в разнообразии смолы оценивались путем сравнения богатства типов смолы (объединенных по колониям) между пасеками/сайтами с помощью хи2-теста Пирсона. Kruskal-Wallis ANOVA был использован для изучения специфических для участка различий в доле отдельных собранных типов смолы. Возможные корреляции между потреблением различных видов смолы и между температурой и общим количеством собирателей смолы анализировали с помощью тау-теста ранговой корреляции Кендалла [48]. Перед анализом данные проверяли на нормальность и однородность вариаций с помощью теста Шапиро-Уилка и теста Флигнера-Киллина.

Чтобы определить ботанические источники смол, собранных пчелами, мы сравнили химический состав смол, собранных пчелами, и смол деревьев. Перед анализом были удалены следовые соединения, составляющие менее 0,05% (образцы смолы) или 0,1% (образцы прополиса) от общей площади пика. Пороговые значения для образцов смолы и прополиса были разными, чтобы учесть более высокую концентрацию образцов прополиса по сравнению с образцами пчелиной и древесной смолы. Все оставшиеся (идентифицированные и неизвестные) вещества отображались по относительным площадям пиков (см. выше), которые использовались для всех последующих статистических анализов. Сначала мы исследовали различия в химическом составе смолы, собранной пчелами, между разными цветовыми типами. Во-вторых, мы проанализировали меж- и внутривидовые различия в химическом составе смол деревьев. Затем мы проанализировали сходство между смолами, собранными пчелами, и смолами деревьев. Все сравнения ((1) типы цвета смолы, (2) смолы деревьев, (3) смолы, собранные пчелами/ смолы деревьев) проводились с помощью тестов перестановки (команда Adonis, пакет R vegan, 10000 прогонов) на основе расстояний Брея-Кертиса между соединениями. Двухмерное NMDS (неметрическое шкалирование размеров), основанное на расстояниях Брея-Кертиса [47], было использовано для создания фигур ординации. Кроме того, различия в химическом составе образцов прополиса из разных колоний и разных мест были проанализированы, как описано выше, но без учета всех алканов и алкенов как потенциально пчелиных/восковых соединений. Все анализы были выполнены в статистическом программном обеспечении R версии 3.4.1 [48]. В связи с многократным тестированием одних и тех же наборов данных мы считали значимыми только значения p-values < 0,01.

Результаты

Потребление смолы

В целом, мы наблюдали 661 возвращающегося сборщика смолы из 28 колоний семи пасек, расположенных на семи различных участках (рис. 2). Среднее количество сборщиков смолы (рассчитанное как среднее общее количество сборщиков смолы, наблюдаемых во всех колониях и на всех участках за каждый месяц) было самым низким в июне (среднее количество пчел [± SD]: 4 ± 5), увеличилось в июле (6 ± 5) и августе (6 ± 6) и снова уменьшилось в сентябре/октябре (5 ± 5). Общее число фуражиров смолы увеличивалось с повышением температуры (тау ранговой корреляции Кендалла: z = 2,42, P < 0,015, тау = 0,16). По колониям и пасекам мы классифицировали семь различных типов смолы в соответствии с их цветом и химическим составом: «охра», оранжево-коричневая (тип «оранжевый»), красно-коричневая (тип «красный»), зелено-коричневая (тип «коричневый»), «желтая», «прозрачная» и «беловатая», причем чаще всего наблюдали «охру» (51% всех зарегистрированных сборщиков смолы) и «оранжевую» (32%) (рис. 2).

В исследуемых колониях было собрано различное количество от трех до пяти различных типов смолы из семи, которые мы наблюдали в общей сложности (рис. 3). Спектры собранной смолы лишь незначительно различались между местами исследований (Adonis: R2 = 0,47, P = 0,047), но сильно различались между некоторыми (даже соседними) колониями (Рис. 3). В то время как смола «охра» собиралась всеми колониями независимо от местоположения (Kruskal-Wallis test: H = 3.62, P = 0.31, рис. 2 и 3A-3E), доля фуражиров, собирающих «апельсин», значительно различалась между участками исследования (Kruskal-Wallis-test: тип «апельсин»: H = 17. 82, P = <0,009) и отрицательно коррелировала с «коричневой» смолой (тау ранговой корреляции Кендалла: z = -3,05, P = 0,002, тау = -0,23). Другие виды смолы были собраны в сравнительно небольшом количестве и только в определенных местах (рис. 3). Разнообразие смолы (т.е. богатство типов смолы) не отличалось между пасеками/местами (хи-квадрат Пирсона: x2 = 1,12, P = 0,77).

Химический анализ — идентификация источников смолы

Смолы, собранные пчелами

В целом, образцы смолы от 39 пчел и 28 отдельных деревьев по крайней мере восьми различных видов из восьми различных мест были проанализированы с помощью ГХ-МС и включали в целом 846 различных соединений, из которых 116 были идентифицированы на основе их индексов удерживания и Коватса (таблицы S1 и S2).

Химический анализ смол, собранных пчелами, выявил семь различных типов (Adonis: R2 = 0,27, P = 0,001; Рис. 4), соответствующих визуально выделенным категориям, описанным выше (Рис. 4). Химический состав образцов смолы одного и того же типа демонстрировал четкие закономерности в относительных пропорциях различных классов веществ (Таблица 2, Рис. 4A), но также различался качественно и/или количественно в пределах и между различными пасеками/сайтами (Таблица 3, Рис. 1, 4B и 4C). Изменчивость внутри типов была наиболее выражена в классах терпенов, особенно сесквитерпенов.

Типы смолы «охра» и «апельсин» сильно различались между образцами отдельных фуражиров с одного и того же и разных участков и частично мало пересекались между собой и с другими типами смолы (Таблица 3, Рис. 4B, S2 Рис). Оба типа характеризовались большим содержанием бензойной и фенольной кислот, а также разнообразных сесквитерпенов и фенольных соединений (табл. 2). Во всех образцах типа «охра» и «апельсин» бензойная кислота (m/z 77, 122; Kovats-Index: 1171) была наиболее распространенным компонентом, причем в образцах типа «охра» она составляла 15,9-47,7% (в среднем 32,1% от относительной площади пика), а в образцах типа «апельсин» 0,8-23,3% бензойной кислоты (в среднем 12,1% от относительной площади пика). «Охра» и «оранжевая» смола далее разделяли один флавоноидный компонент (время удерживания (RT) 39,0 мин) и около шести сесквитерпенов (например, альфа-гумулен, Е-изоэвгенол, альфа-гуаин и кариофиллен/оксид). В отличие от «охристой» и «оранжевой» смолы, изменчивость химического состава была относительно низкой среди образцов «коричневой» смолы с разных участков (рис. 4, табл. 3). Они содержали в основном сесквитерпены и другие терпеноиды, только несколько фенольных соединений и почти не содержали бензойной или фенольной кислот (табл. 2). Три сесквитерпена (Z-бета-фарнезен и два неидентифицированных сесквитерпена (время удерживания 21,58 мин и 24,78 мин) были наиболее многочисленными (составляли 33,3-54,5%, в среднем 46,4% от общей площади пика). Они присутствовали исключительно во всех образцах типа «коричневый» и далее были обнаружены во всех образцах прополиса. Интересно, что эти сесквитерпены присутствовали только в смолах видов деревьев B. alba, которые использовались пчелами, но не в смолах видов, не собираемых пчелами (рис. 4).

Смолы деревьев.

Смолы деревьев отличались высоким химическим разнообразием: до 300 и более различных соединений (включая следовые соединения) в одном образце (среднее количество соединений на образец [± стандартное отклонение] = 230 ± 133 соединения). Наибольшее разнообразие было обнаружено в смолах почек P. x canadensis (рис. 5D). Химический состав варьировался между различными видами деревьев (Adonis: R2 = 0,60, P = 0,009; рис. 6D). Тополь демонстрировал сравнительно большую внутривидовую изменчивость (рис. 6C, 6D и 6E и рис. 5A-5D). Химический состав варьировал между особями P. x canadensis с разных участков, а также между соседними деревьями (рис. 5D), демонстрируя три различных (хемо)типа P. x canadensis (далее обозначаемых как P. x canadensis тип1, тип2 и тип3), два из которых были похожи на тип смолы «оранжевый» (рис. 5D). Образцы смолы P. x canadensis тип1 и тип2, а также P. balsamifera характеризовались сравнительно большим количеством бензойной и фенольной кислот (доля от общей площади пика [± стандартное отклонение]: 26,3 ± 14. 3%) и низким количеством монотерпенов (доля: 0. ± 0,3), тогда как образцы P. x canadensis type3 демонстрировали противоположную тенденцию (доля бензойной и фенольной кислот: 0,2 ± 0,2; доля монотерпенов: 3,9 ± 1,3). Для B. alba мы обнаружили два различных (хемо)типа смолы (каждый с двумя особями) в целом на трех разных участках, причем две соседние особи с одного участка принадлежали к разным (хемо)типам (рис. 6D).

Следующие типы смолы, собранной пчелами, химически соответствовали конкретным видам деревьев: тип «оранжевый» химически соответствовал P. x canadensis тип1 и тип2, тип «коричневый» соответствовал B. alba тип1, тип «красный» соответствовал P. balsamifera, тип «чистый» соответствовал A. hippocastanum и тип «беловатый» соответствовал двум отобранным хвойным деревьям (Picea abis / Pinus sylvestris). Для типов «охра» и «желтый» четких соответствий не было найдено (рис. 5). Таким образом, пчелы собирали смолы из почек деревьев P. x canadensis, P. balsamifera, B. alba, A. hippocastanum и из ран хвойных пород деревьев (например, P. abis или P. sylvestris) (рис. 6). Ни одна из собранных пчелами смол не показала химического сходства с образцами смол, собранных с A. glutinosa, B. alba тип2 и P. x canadensis тип3 (рис. 6). В то время как смола типа «охра» не соответствовала однозначно ни одному дереву, она содержала до девяти соединений, которые были обнаружены исключительно в образцах смолы тополя. Аналогично, смола типа «желтая» частично совпадала с типом «охра», но содержала соединения (например, D-лимонен и 3-карен), которые были обнаружены в основном в хвойных смолах.

Наконец, образцы прополиса из 10 колоний пяти пасек различались по химическому составу между колониями одного и того же участка и разных пасек (рис. 7). По сравнению с одиночными смолами, собранными пчелами, образцы прополиса были более похожи друг на друга, чем на любой из типов одиночных смол (рис. 7). Более того, мы обнаружили лишь относительно небольшое количество совпадений соединений между смолами, собранными пчелами, и образцами прополиса (табл. 2).

Обсуждение

Медоносные пчелы собирают растительные смолы для различных целей, таких как защита от вредителей и патогенов, а также для строительства и запечатывания гнезд [36,49]. Несмотря на свою важность, очень мало известно о точных источниках смолы, а также о вариациях в спектрах и разнообразии смол, собираемых медоносными пчелами.

Источники смолы, используемые медоносными пчелами

Мы провели химическое сравнение смолы, собранной с кормушек, и смолы, отобранной из почек деревьев. Результаты показали, что пчелы из наших колоний собирали смолу не только с нескольких видов тополей (P. balsamifera, P. x canadensis), но и с березы (B. alba), конского каштана (A. hippocastanum) и хвойных деревьев (P. abis или P. sylvestris). Хотя использование смолы тополя уже было подтверждено предыдущими исследованиями [39,45,50], наше исследование предоставляет первые доказательства использования более широкого спектра источников смолы, включая виды тополя, березы, конского каштана и хвойных деревьев.

Однако, несмотря на явное композиционное сходство, мы не обнаружили близкого соответствия между смолами, собранными пчелами, и образцами растений, что может частично объясняться высокой изменчивостью внутри и между различными таксонами растений. Внутривидовая изменчивость химического состава смолы была особенно выражена среди древесных особей тополя и березы, которые, как известно, создают большое разнообразие гибридов, которые часто трудно различить по морфологическим признакам [51—63], но которые могут сильно отличаться по химическому составу смолы [39,62].

Интересно, что мы не смогли однозначно определить точный растительный источник часто собираемого типа смолы «охра». Хотя этот тип содержал несколько соединений (до девяти), также обнаруженных в смолах P. x canadensis и P. tremula, его химический состав не полностью совпадал с составом смол почек тополя, взятых в качестве образца. Действительно, по крайней мере 45 соединений (в основном сесквитерпены), обнаруженных в смоле P. x canadensis, отсутствовали в смоле типа «охра».

Отсутствие или неполное совпадение между смолами, собранными пчелами, и образцами смолы почек потенциальных растений-источников может указывать на то, что пчелы собирали либо с исходных деревьев, либо с частей деревьев (например, кроны), которые мы не пробовали и которые химически отличаются от наших образцов деревьев. В качестве альтернативы, пчелы, собирающие смолу, могут каким-то образом изменять смолу в процессе сбора, например, путем ферментативной деградации определенных соединений или изменения состава соединений, обычно производимых деревом.

Более того, собранные пчелами образцы определенного типа смолы (например, «оранжевой» и «коричневой») из колоний разных пасек иногда были очень похожи (48,3-62,9% перекрытия площади, см. таблицу 3 и рисунки 5 и 6), что позволяет предположить, что пчелы выбирают определенные (хемо)типы независимо от местоположения и вербуют фуражиров на эти растения [64]. На самом деле, пчелы не обязательно собирали смолы из ближайших доступных источников, но были очень избирательны и делали выбор в пользу определенных (хемо)типов даже среди близкородственных и частично соседних видов/особей деревьев, которые сильно отличались по химическому составу смолы почек. Аналогичным образом, медоносные пчелы в Северной Америке собирали смолы P. deltoides и P. balsamifera, но не их многочисленные гибриды, которые, как было показано, производят смолы почек с химическими профилями, промежуточными по отношению к различным профилям их родительских видов [39].

Функциональная роль бензойной кислоты и ее производных?

Как «охра», так и «оранжевая» смола содержали заметное количество бензойной кислоты (т.е. 32,1 ± 9,6% в «охре» и 12,1 ± 8,2% в «оранжевой»), что было характерно для всех образцов обоих типов. Бензойная кислота также присутствовала в смолах некоторых, но не всех особей P. x canadensis и P. tremula, хотя и в гораздо меньших концентрациях (например, 1,6 ± 2,4%). Бензойная кислота — это ароматическое соединение, широко используемое людьми для сохранения продуктов питания благодаря своей антимикробной и антимикотической активности [65]. В растениях бензойные кислоты и их производные играют центральную роль в привлечении полезных насекомых, например, опылителей, и в защите, например, от травоядных или других вредителей [66—68]. Например, у древесных растений повышенное производство бензойной кислоты в плодах происходит, когда они заражены грибком, вызывающим «рак дерева» (Nectria galligena) [69]. Следовательно, бензойная кислота обладает биологическими свойствами, которые могут быть полезны для пчел. Более того, в отличие от большинства других химических соединений, которые обычно считаются ответственными за биологическую активность прополиса (например, фенольных соединений или терпенов), бензойная кислота растворима в воде. Она также регулярно встречается в меде [70] и, вероятно, способствует сохранности меда. Учитывая ее распространенность в смоле, бензойная кислота в меде может быть (по крайней мере, частично) получена из хранилищ смолы (прополиса). Действительно, относительное количество бензойной кислоты было намного ниже в образцах прополиса, чем в образцах свежесобранной смолы, что позволяет предположить, что она испаряется в пчелиных колониях (и, например, в мед). Аналогично, три других типичных компонента смолы почек тополя (пинобанксин, пинобанксин 5-метиловый эфир и пиноцембрин, которые вызывают детоксикацию ферментов CYP9Q) также накапливались в меде [71]. Благодаря своей летучести бензойная кислота может помогать медоносным пчелам находить источники смолы и таким образом функционировать как химическая подсказка. Относительно большое количество другого производного бензойной кислоты, бензилбензоата (индекс Коватса 1762), также было обнаружено в некоторых собранных пчелами смолах типов «красный» и «охра», а также в P. balsamifera (Таблица S2). Он используется в качестве фармацевтического акарицида, например, против скабиса, и поэтому может защищать пчел от клещей варроа (Varroa destructor).

Могут ли медоносные пчелы индуцировать секрецию предпочтительных типов смол?

Поскольку защитная реакция растений обычно приводит к накоплению защитных соединений, таких как бензойная кислота [72], преимущественный сбор различных хемотипов (например, богатых бензойной кислотой) нашими пчелами может даже указывать на то, что пчелы предпочитают смолы, вырабатываемые в качестве защиты от стрессовых факторов. Защитная реакция растения может дополнительно увеличить общее выделение смолы (например, у осины, у которой было сравнительно мало смолы в почках в исследуемом регионе, личное наблюдение), как это известно для березы и тополя, когда их объедают зайцы-беляки [73—75]. Помимо механических повреждений, химические вещества (например, ферменты) из ротовых выделений и микробы, связанные с насекомыми, могут вызывать защитные реакции и таким образом индуцировать или поддерживать выделения и/или изменять их химический состав [76—79]. Более того, собиратели смолы иногда повреждают вегетативные части растений (например, почки или листья) [36,38], что может вызвать/увеличить выделение смолы. При этом они могут переносить микробные симбионты (связанные со слюной пчел) или патогенные микробы (см. [80—82]) и таким образом потенциально вызывать производство предпочтительных хемотипов смолы. Если эта гипотеза верна, то это может объяснить отсутствие совпадений в химическом сходстве между нашими образцами деревьев и образцами, собранными пчелами.

Потребление смолы, изменчивость и разнообразие

Исследуемые нами колонии пчел явно предпочитали два химически отличных типа смолы, «охра» (неизвестный источник, вероятно, тополь) и «оранжевая» (P. x canadensis), всем другим источникам. Сильное предпочтение одних смол перед другими согласуется с предыдущими исследованиями [39,43]. Однако большинство наших колоний собрали три или более различных типов смолы, что указывает на то, что пчелы выбирают множество различных смол. Спектры собранных смол, в свою очередь, различались между пасеками/площадками и колониями, что указывает на независимые от колоний цели сбора. Однако образцы прополиса из наших колоний были химически более похожи друг на друга, чем на собранные пчелами типы смол, что говорит о том, что колонии составляют специфические смеси смол из множества различных смол. Различные смолы обладают различными функциональными свойствами, например, отталкивают различные антагонисты [83]. Компиляция смолы из разных источников, таким образом, увеличивает разнообразие потенциально биологически активных соединений и, следовательно, может лучше защищать колонии от различных врагов [83]. На самом деле, наш химический анализ выявил поразительное композиционное химическое разнообразие внутри и среди различных типов/источников смолы. Таким образом, помимо сбора смолы из сравнительно широкого спектра различных видов растений (как это было показано для пчел без жала: [46]), пчелы могут извлечь дополнительную пользу из большой химической внутривидовой изменчивости, обнаруженной в смоле конкретных видов растений.

Заключение

Наши данные показывают, что медоносные пчелы собирают сравнительно широкий и весьма изменчивый спектр источников смолы и делают особый выбор, предпочитая одни смолы (например, конкретные виды тополя и хемотипы) другим. Этот вывод соответствует наблюдениям, сделанным для их тропических родственников (Apidae: Meliponini) [23,84], и, вероятно, гарантирует, что пчелы могут бороться с различными антагонистами, чувствительными к различным источникам смолы и/или соединениям (см. [83]). Примечательно, что окружающая среда в районе нашего исследования сформировалась под интенсивным воздействием человека, что привело к изменению набора доступных видов растений. Например, ранее встречавшиеся виды тополей, такие как Populus nigra, теперь крайне редки и, скорее всего, недоступны ни для одной из наших пасек. Вместо этого в нашем регионе доступны несколько посаженных и естественных гибридов P. nigra и других видов тополей. В неизмененной, нетронутой среде предпочтения пчел могут быть смещены в сторону других (или даже более разнообразных) ресурсов для составления смесей смол, которые наилучшим образом удовлетворяют их текущие потребности. Однако высокая химическая изменчивость, обнаруженная среди типов смолы, собранных нашими пчелами, может альтернативно указывать на то, что пчелы нацелены и извлекают выгоду из химического, а не древесного биоразнообразия.

Будущие исследования должны попытаться раскрыть причины, лежащие в основе выбора и изменчивости в потреблении смолы, наблюдаемых у медоносных пчел. Такие знания не только дадут новое представление о самолечении и внешнем иммунитете у насекомых, но и предоставят важную информацию для практической деятельности пчеловодов.

Вспомогательная информация

S1 Рис. Расположение исследуемых пасек.
(DOCX)

S2 Рис. Примерные хроматограммы.
(DOCX)

S1 Таблица. Список классов веществ и числовых компонентов, идентифицированных в образцах смолы.
(DOCX)

S2 Таблица. Список всех веществ, идентифицированных из образцов смолы деревьев, пчел и прополиса, и их относительное количество.
(XLSX)

Ссылки:

1.Gisder S, Genersch E Special Issue: Honey bee viruses. Viruses. 2015; 7: 5603–5608. pmid:26702462
View Article
PubMed/NCBI
Google Scholar

2.Moritz RFA, de Miranda J, Fries I, Le Conte Y, Neumann P, Paxton RJ Research strategies to improve honeybee health in Europe. Apidologie. 2010; 41: 227–242
View Article
Google Scholar

3.vanEngelsdorp D, Meixner MD A historical review of managed honey bee populations in Europe and the United States and the factors that may affect them. Journal of Invertebrate Pathology. 2010; 103: S80–S95.https://doi.org/10.1016/j.jip.2009.06.011 pmid:19909973
View Article
PubMed/NCBI
Google Scholar

4.Jose Orantes-Bermejo F, Gomez Pajuelo A, Megias Megias M, Torres Fernandez-Pinar C Pesticide residues in beeswax and beebread samples collected from honey bee colonies (Apis mellifera L.) in Spain. Possible implications for bee losses. Journal of Apicultural Research. 2010; 49: 243–250
View Article
Google Scholar

5.Klee J, Besana AM, Genersch E, Gisder S, Nanetti A, Tam DQ, et al. Widespread dispersal of the microsporidian Nosema ceranae, an emergent pathogen of the western honey bee, Apis mellifera. Journal of Invertebrate Pathology. 2007; 96: 1–10 pmid:17428493
View Article
PubMed/NCBI
Google Scholar

6.Alaux C, Ducloz F, Crauser D, Le Conte Y Diet effects on honeybee immunocompetence. Biology Letters. 2010; 6: 562–565 pmid:20089536
View Article
PubMed/NCBI
Google Scholar

7.Johnson RM, Ellis MD, Mullin CA, Frazier M Pesticides and honey bee toxicity—USA. Apidologie. 2010; 41: 312–331
View Article
Google Scholar

8.DeGrandi-Hoffman G, Chen Y Nutrition, immunity and viral infections in honey bees. Current Opinion in Insect Science. 2015; 10: 170–176.https://doi.org/10.1016/j.cois.2015.05.007 pmid:29588005
View Article
PubMed/NCBI
Google Scholar

9.Donkersley P, Rhodes G, Pickup RW, Jones KC, Power EF, Wright GA, et al. Nutritional composition of honey bee food stores vary with floral composition. Oecologia. 2017; 185: 749–761. pmid:29032464
View Article
PubMed/NCBI
Google Scholar

10.Goulson D, Nicholls E, Botias C, Rotheray EL Bee declines driven by combined stress from parasites, pesticides, and lack of flowers. Science. 2015; 347: 1255957. pmid:25721506
View Article
PubMed/NCBI
Google Scholar

11.Spivak M, Reuter GS Resistance to American foulbrood disease by honey bee colonies Apis mellifera bred for hygienic behavior. Apidologie. 2001; 32: 555–565
View Article
Google Scholar

12.Spivak M Honey bee hygienic behavior and defense against Varroa jacobsoni. Apidologie. 1996; 27: 245–260
View Article
Google Scholar

13.Niño EL, Cameron JW Improving the future of honey bee breeding programs by employing recent scientific advances. Current Opinion in Insect Science. 2015; 10: 163–169.https://doi.org/10.1016/j.cois.2015.05.005 pmid:29588004
View Article
PubMed/NCBI
Google Scholar

14.Ibrahim A, Reuter G, S., Spivak M Field trial of honey bee colonies bred for mechanisms of resistance against Varroa destructor. Apidologie. 2007; 38: 67–76
View Article
Google Scholar

15.Evans JD, Spivak M Socialized medicine: Individual and communal disease barriers in honey bees. Journal of Invertebrate Pathology. 2010; 103: S62–S72. pmid:19909975
View Article
PubMed/NCBI
Google Scholar

16.Breed MD, Guzman-Novoa E, Hunt GJ Defensive behaviour of honey bees: Organization, genetics, and comparisons with other bees. Annual Review of Entomology. 2004; 49: 271–298 pmid:14651465
View Article
PubMed/NCBI
Google Scholar

17.Cremer S, Armitage SAO, Schmid-Hempel P Social immunity. Current Biology. 2007; 17: R693–R702 pmid:17714663
View Article
PubMed/NCBI
Google Scholar

18.Otti O, Tragust S, Feldhaar H Unifying external and internal immune defences. Trends in Ecology & Evolution. 2014; 29: 625–634. pmid:25278329
View Article
PubMed/NCBI
Google Scholar

19.Simone-Finstrom M, Evans JD, Spivak M Resin collection and social immunity in honey bees. Evolution. 2009; 63: 3016–3022 pmid:19619221
View Article
PubMed/NCBI
Google Scholar

20.Simone-Finstrom M, Borba R, Wilson M, Spivak M Propolis counteracts some threats to honey bee health. Insects. 2017; 8: 46
View Article
Google Scholar

21.Langenheim JH Plant resins: Chemistry, evolution, ecology, and ethnobotany. Portland, Cambridge: Timber Press. 2003.

22.Duangphakdee O, Koeniger N, Deowanish S, Hepburn HR, Wongsiri S Ant repellent resins of honeybees and stingless bees. Insectes Sociaux. 2009; 56: 333–339.
View Article
Google Scholar

23.Leonhardt SD, Blüthgen N A sticky affair: Resin collection by bornean stingless bees. Biotropica. 2009; 41: 730–736
View Article
Google Scholar

24.Roubik DW Stingless bee nesting biology. Apidologie. 2006; 37: 124–143
View Article
Google Scholar

25.Ghisalberti EL Propolis: A review. Bee World. 1979; 60: 59–84
View Article
Google Scholar

26.Seeley TD, Morse RA The nest of the honey-bee (Apis mellifera L.). Insectes Sociaux. 1976; 23: 43–63
View Article
Google Scholar

27.Bastos E, Simone M, Jorge DM, Soares AEE, Spivak M In vitro study of the antimicrobial activity of Brazilian propolis against Paenibacillus larvae. Journal of Invertebrate Pathology. 2008; 97: 273–281. pmid:18054037
View Article
PubMed/NCBI
Google Scholar

28.Wilson MB, Brinkman D, Spivak M, Gardner G, Cohen JD Regional variation in composition and antimicrobial activity of US propolis against Paenibacillus larvae and Ascosphaera apis. Journal of Invertebrate Pathology. 2015; 124: 44–50 pmid:25450740
View Article
PubMed/NCBI
Google Scholar

29.Borba RS, Spivak M Propolis envelope in Apis mellifera colonies supports honey bees against the pathogen, Paenibacillus larvae. Scientific Reports. 2017; 7: 11429. pmid:28900241
View Article
PubMed/NCBI
Google Scholar

30.Simone-Finstrom MD, Spivak M Increased resin collection after parasite challenge: A case of self-medication in honey bees? PLOS ONE. 2012; 7:
View Article
Google Scholar

31.Borba RS, Klyczek KK, Mogen KL, Spivak M Seasonal benefits of a natural propolis envelope to honey bee immunity and colony health. Journal of Experimental Biology. 2015; 218: 3689–3699. pmid:26449975
View Article
PubMed/NCBI
Google Scholar

32.Drescher N, Klein A-M, Neumann P, Yañez O, Sara DL Inside honeybee hives: Impact of natural propolis on the ectoparasitic mite Varroa destructor and viruses. Insects. 2017; 8: 1–18. pmid:28178181
View Article
PubMed/NCBI
Google Scholar

33.Nicodemo D, Malheiros EB, De Jong D, Nogueira Couto RH Increased brood viability and longer lifespan of honeybees selected for propolis production. Apidologie. 2013; 45: 269–275.
View Article
Google Scholar

34.Simone-Finstrom M Social immunity and the superorganism: Behavioral defenses protecting honey bee colonies from pathogens and parasites. Bee World. 2017; 94: 21–29.
View Article
Google Scholar

35.Wallace HM, Lee DJ Resin-foraging by colonies of Trigona sapiens and T. hockingsi (Hymenoptera: Apidae, Meliponini) and consequent seed dispersal of Corymbia torelliana (Myrtaceae). Apidologie. 2010; 41: 428–435
View Article
Google Scholar

36.Huber F New observations upon bees. The completion of the cell. In: Dadant CP, editor. American Bee Journal.1814.

37.Alfonsus EC Some sources of propolis: Methods of gathering and conditions under which this work is done. Gleanings in Bee Culture. 1933; 61: 92–93
View Article
Google Scholar

38.Teixeira EW, Negri G, Meira R, Message D, Salatino A Plant origin of green propolis: Bee behavior, plant anatomy and chemistry. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2005; 2: 85–92 pmid:15841282
View Article
PubMed/NCBI
Google Scholar

39.Wilson MB, Spivak M, Hegeman AD, Rendahl A, Cohen JD Metabolomics reveals the origins of antimicrobial plant resins collected by honey bees. PLOS ONE. 2013; 8: 1–13.e77512, pmid:24204850
View Article
PubMed/NCBI
Google Scholar

40.Borba CM Constitutive and therapeutic benefits of plant resins and a propolis envelope to honey bee, Apis mellifera L., immunity and health. Minnesota: University of Minnesota.2015.

41.Bankova VS, de Castro SL, Marcucci MC Propolis: Recent advances in chemistry and plant origin. Apidologie. 2000; 31: 3–15
View Article
Google Scholar

42.Isidorov VA, Bakier S, Pirożnikow E, Zambrzycka M, Swiecicka I Selective behaviour of honeybees in acquiring European propolis plant precursors. Journal of Chemical Ecology. 2016; 42: 475–485. pmid:27294416
View Article
PubMed/NCBI
Google Scholar

43.Bankova V, Popova M, Trusheva B Plant sources of propolis: An update from a chemist’s point of view. Natural Product Communications. 2006; 1: 1023–1028
View Article
Google Scholar

44.Crane E Beekeeping. Heinemann: London. 1988.

45.Greenaway W, Scaysbrook T, Whatley FR The composition and plant origin of propolis: A report of work at Oxford. Bee World. 1990; 71: 107–118
View Article
Google Scholar

46.Kaluza BF, Wallace H, Keller A, Heard TA, Jeffers B, Drescher N, et al. Generalist social bees maximize diversity intake in plant species-rich and resource-abundant environments. Ecosphere. 2017; 8.
View Article
Google Scholar

47.Oksanen J, Blanchet FG, Friendly M, Kindt R, Legendre P, McGlinn D, et al. Vegan: Community Ecology Package. R package version 2.4–3. ed.2017.
View Article
Google Scholar

48.R Core Team R: A Language and Environment for Statistical Computing. In: https://www.r-project.org/, editor: R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria.2017

49.Simone-Finstrom M, Spivak M Propolis and bee health: The natural history and significance of resin use by honey bees. Apidologie. 2010; 41: 295–311
View Article
Google Scholar

50.Bankova V, Popova M, Bogdanov S, Sabatini AG Chemical composition of European propolis: Expected and unexpected results. Zeitschrift für Naturforschung C-A Journal of Biosciences. 2002; 57: 530–533
View Article
Google Scholar

51.Thompson SL, Lamothe M, Meirmans PG, Perinet P, Isabel N Repeated unidirectional introgression towards Populus balsamifera in contact zones of exotic and native poplars. Molecular Ecology. 2010; 19: 132–145. pmid:20002578
View Article
PubMed/NCBI
Google Scholar

52.Walters SM Betula L. in Britain. Proceedings of the Botanical Society of the British Isles. 1968; 7: 179–180
View Article
Google Scholar

53.Atkinson MD The occurrence of natural hybrids between Betula Pendula Roth (B. Verrucosa Ehrh.) and B. Pubescens Ehrh. Journal of Ecology. 1992; 80: 837–870.
View Article
Google Scholar

54.Gardiner AS, Pearce NJ Leaf shape as an indicator of introgression between Betula pendula and B. pubescens. Botanical Society of Edinburgh. 1978; 43: 91–103
View Article
Google Scholar

55.Cronk QCB Plant eco-devo: The potential of poplar as a model organism. New Phytologist. 2005; 166: 39–48. pmid:15760349
View Article
PubMed/NCBI
Google Scholar

56.Lindtke D, González-Martínez SC, Macaya-Sanz D, Lexer C Admixture mapping of quantitative traits in Populus hybrid zones: Power and limitations. Heredity. 2013; 111: 474–485. pmid:23860234
View Article
PubMed/NCBI
Google Scholar

57.Ceulemans R, Scarascia-Mugnozza G, Wiard BM, Braatne JH, Hinckley TM, Stettler RF, et al. Production physiology and morphology of Populus species and their hybrids grown under short rotation. I. Clonal comparisons of 4-year growth and phenology. Canadian Journal of Forest Research. 1992; 22: 1937–1948.
View Article
Google Scholar

58.Eckenwalder JE Systematics and evolution of Populus. In: Stettler RF, Bradshaw HD, Heilman PE, Hinckler TM, editors. Biology of Populus and its implications for management and conservation. Ottawa: Canadian Government Publishing: Canadian Government.1996.

59.Johnsson H Interspecific hybridization within the genus Betula. Hereditas. 1945; 31: 163–176. pmid:21021067
View Article
PubMed/NCBI
Google Scholar

60.Smith RL, Sytsma KJ Evolution of Populus nigra (Sect. Aigeiros): Introgressive Hybridization and the Chloroplast Contribution of Populus alba (Sect. Populus). American Journal of Botany. 1990; 77: 1176–1187.
View Article
Google Scholar

61.Howland DE, Oliver RP, Davy AJ Morphological and molecular variation in natural populations of Betula. New Phytologist. 1995; 130: 117–124.
View Article
Google Scholar

62.Isidorov V, Szczepaniak L, Wróblewska A, Pirożnikow E, Vetchinnikova L Gas chromatographic-mass spectrometric examination of chemical composition of two Eurasian birch (Betula L.) bud exudates and its taxonomical implication. Biochemical Systematics and Ecology. 2014; 52: 41–48.https://doi.org/10.1016/j.bse.2013.12.008
View Article
Google Scholar

63.Migalina SV, Ivanova LA, Makhnev AK Changes of leaf morphology in Betula pendula roth and B. pubescens Ehrh. along a zonal-climatic transect in the Urals and Western Siberia. Russian Journal of Ecology. 2010; 41: 293–301.https://doi.org/10.1134/S106741361004003X
View Article
Google Scholar

64.Nakamura J, Seeley TD The functional organization of resin work in honeybee colonies. Behavioral Ecology and Sociobiology. 2006; 60: 339–349.
View Article
Google Scholar

65.del Olmo A, Calzada J, Nuñez M Benzoic acid and its derivatives as naturally occurring compounds in foods and as additives: Uses, exposure, and controversy. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 2017; 57: 3084–3103. pmid:26587821
View Article
PubMed/NCBI
Google Scholar

66.Widhalm JR, Dudareva N A familiar ring to it: Biosynthesis of plant benzoic acids. Molecular Plant. 2015; 8: 83–97. pmid:25578274
View Article
PubMed/NCBI
Google Scholar

67.Arimura G, Matsui K, Takabayashi J Chemical and molecular ecology of herbivore-induced plant volatiles: Proximate factors and their ultimate functions. Plant & Cell Physiology. 2009; 50: 911–923
View Article
Google Scholar

68.Maffei ME Sites of synthesis, biochemistry and functional role of plant volatiles. South African Journal of Botany. 2010; 76: 612–631.https://doi.org/10.1016/j.sajb.2010.03.003
View Article
Google Scholar

69.Brown AE, Swinburne TR Benzoic acid: An antifungal compound formed in Bramley’s Seedling apple fruits following infection by Nectria galligena Bres. Physiological Plant Pathology. 1971; 1: 469–475.https://doi.org/10.1016/0048-4059(71)90009-9
View Article
Google Scholar

70.Kaškonienė V, Venskutonis PR Floral markers in honey of various botanical and geographic origins: A review. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. 2010; 9: 620–634.
View Article
Google Scholar

71.Mao W, Schuler MA, Berenbaum MR Honey constituents up-regulate detoxification and immunity genes in the western honey bee Apis mellifera. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2013; 110: 8842–8846. pmid:23630255
View Article
PubMed/NCBI
Google Scholar

72.Fürstenberg-Hägg J, Zagrobelny M, Bak S Plant defense against insect herbivores. International Journal of Molecular Sciences. 2013; 14: 10242 pmid:23681010
View Article
PubMed/NCBI
Google Scholar

73.Reichardt PB, Bryant JP, Clausen TP, Wieland GD Defense of winter-dormant Alaska paper birch against snowshoe hares. Oecologia. 1984; 65: 58–69. pmid:28312110
View Article
PubMed/NCBI
Google Scholar

74.Reichardt PB, Bryant JP, Mattes BR, Clausen TP, Chapin FS, Meyer M Winter chemical defense of Alaskan balsam poplar against snowshoe hares. Journal of Chemical Ecology. 1990; 16: 1941–1959. pmid:24263997
View Article
PubMed/NCBI
Google Scholar

75.Bryant JP, Reichardt PB, Clausen TP, Provenza FO, Kuropat PJ Woody plant mammal interactions. In: Rosenthal GA, Berenbaum MR, editors. Herbivores: Their interactions with secondary metabolites. New York: Academic Press.1992.

76.Sugio A, Dubreuil G, Giron D, Simon JC Plant-insect interactions under bacterial influence: Ecological implications and underlying mechanisms. Journal of Experimental Botany. 2015; 66: 467–478. pmid:25385767
View Article
PubMed/NCBI
Google Scholar

77.Halitschke R, Schittko U, Pohnert G, Boland W, Baldwin IT Molecular interactions between the specialist herbivore Manduca sexta (Lepidoptera, Sphingidae) and its natural host Nicotiana attenuata. III. Fatty acid-amino acid conjugates in herbivore oral secretions are necessary and sufficient for herbivore-specific plant responses. Plant Physiology. 2001; 125: 711–717 pmid:11161028
View Article
PubMed/NCBI
Google Scholar

78.Unsicker SB, Gershenzon J, Kollner TG Beetle feeding induces a different volatile emission pattern from black poplar foliage than caterpillar herbivory. Plant Signal Behavior. 2015; 10: e987522. pmid:25831045
View Article
PubMed/NCBI
Google Scholar

79.Delorme L, Lieutier F Monoterpene composition of the preformed and induced resins of Scots pine, and their effect on bark beetles and associated fungi. European Journal of Forest Pathology. 1990; 20: 304–316.
View Article
Google Scholar

80.Corby-Harris V, Maes P, Anderson KE The bacterial communities associated with honey bee (Apis mellifera) foragers. PLOS ONE. 2014; 9: e95056. pmid:24740297
View Article
PubMed/NCBI
Google Scholar

81.Singh R, Levitt AL, Rajotte EG, Holmes EC, Ostiguy N, Vanengelsdorp D, et al. RNA viruses in hymenopteran pollinators: Evidence of inter-Taxa virus transmission via pollen and potential impact on non-Apis hymenopteran species. PLOS ONE. 2010; 5: e14357. pmid:21203504
View Article
PubMed/NCBI
Google Scholar

82.Anderson KE, Sheehan TH, Mott BM, Maes P, Snyder L, Schwan MR, et al. Microbial ecology of the hive and pollination landscape: Bacterial associates from floral nectar, the alimentary tract and stored food of honey bees (Apis mellifera). PLOS ONE. 2013; 8: e83125. pmid:24358254
View Article
PubMed/NCBI
Google Scholar

83.Drescher N, Wallace HM, Katouli M, Massaro CF, Leonhardt SD Diversity matters: How bees benefit from different resin sources. Oecologia. 2014; 4: 943–953.
View Article
Google Scholar

84.Leonhardt SD, Zeilhofer S, Blüthgen N, Schmitt T Stingless bees use terpenes as olfactory cues to find resin sources. Chemical Senses. 2010; 35: 603–611 pmid:20534774
View Article
PubMed/NCBI
Google Scholar