Высокоэффективное CRISPR/Cas9-опосредованное редактирование генов в эмбрионах медоносной пчелы (Apis mellifera)

Аннотация

Медоносная пчела (Apis mellifera) — важное насекомое-опылитель полевых цветов и сельскохозяйственных культур, играющее важную роль в глобальной экосистеме. Кроме того, медоносная пчела служит идеальной моделью социального насекомого. Поэтому функциональные исследования генов медоносной пчелы представляют большой интерес. Однако до сих пор эффективные методы манипулирования генами медоносной пчелы были недоступны. Здесь мы представили усовершенствованный метод редактирования генов CRISPR/Cas9 путем микроинъекции sgRNA и белка Cas9 в область образования зиготы в течение 2 часов после яйцекладки матки, что позволяет одномоментно получить биаллельные нокаутные мутанты у медоносной пчелы с высокой эффективностью. Сначала мы нацелились на ген Mrjp1. Две партии эмбрионов медоносной пчелы были собраны и инъецированы сгРНК Mrjp1 и белком Cas9 в вентральную цефалическую сторону и дорсальную заднюю сторону эмбрионов, соответственно. Скорость редактирования генов на вентральной цефалической стороне составила 93,3%, что было намного выше, чем при инъекции на дорсально-задней стороне (11,8%). Чтобы подтвердить высокую эффективность нашей системы редактирования генов медоносной пчелы, мы нацелились на другой ген, Pax6, и ввели Pax6 sgRNA и белок Cas9 в вентральную цефалическую сторону в третьей партии. Скорость редактирования составила 100%. Sanger-секвенирование клонов TA показало, что 73,3% (для Mrjp1) и 76,9% (для Pax6) отредактированных эмбрионов текущего поколения были биаллельными нокаут-мутантами. Эти результаты показывают, что созданный нами метод CRISPR/Cas9 позволяет осуществлять одномоментный биаллельный нокаут целевых генов в эмбрионах медоносной пчелы, демонстрируя тем самым возможность эффективного применения для функциональных исследований генов медоносной пчелы. Этот метод также является полезным примером редактирования генов у других насекомых с удлиненными яйцами.

Медоносная пчела Apis mellifera является важным опылителем диких цветов и сельскохозяйственных культур, оказывая большое влияние на разнообразие растений в экологической среде (Aizen and Harder 2009; Klein et al. 2007). Медоносные пчелы обладают сложным социальным поведением, включая сообщение о местонахождении источника пищи с помощью танца виляния, специализацию членов колонии на выполнении задач и групповое реагирование на возмущения окружающей среды (Bonabeau et al. 1997; Franks et al. 2002; Williams et al. 2010). Поэтому медоносная пчела часто используется в качестве модельного организма для изучения социальной организации и поведения насекомых, физиологии и развития, молекулярных нервных механизмов и генетики насекомых (Winston 1991; Menzel and Muller 1996; Caron and Connor 2013; Cridge et al. 2017). Чтобы понять эти интересные особенности медоносных пчел, многие функциональные гены были изучены с помощью различных молекулярно-биологических методов, включая РНК-интерференцию (Beye et al. 2002; Dearden et al. 2009), гибридизацию in situ (Fleig et al. 1988; Osborne and Dearden 2005; Walldorf et al. 1989), иммуногистохимия (Fleig 1990), трансгенез с использованием транспозона piggyBac (Schulte et al. 2014) и редактирование генома с помощью кластеризованных регулярных палиндромных повторов (CRISPR)-ассоциированного белка (Cas9) (Kohno et al. 2016; Kohno and Kubo 2018).

В настоящее время CRISPR/Cas9-опосредованное редактирование генов широко используется у разных видов (Belhaj et al. 2013; Gratz et al. 2013; Hwang et al. 2013; Jiang et al. 2013) для понимания функции целевых генов благодаря простоте работы и высокой эффективности. Первое применение системы CRISPR/Cas9 у членистоногих было осуществлено в 2013 году на модельном насекомом — плодовой мушке Drosophila melanogaster (Gratz et al. 2013), затем последовал шелковый червь Bombyx mori (Wang et al. 2013) в том же году; затем эта система была использована у других разнообразных насекомых, включая комара (Dong et al. 2015), ювелирную осу (Li et al. 2017), бабочку (Perry et al. 2016) и медоносную пчелу (Kohno et al. 2016; Kohno and Kubo 2018). Однако эффективность редактирования с помощью CRISPR/Cas9 у насекомых в целом была ниже, чем у млекопитающих (Sun et al. 2017). Почти нет сообщений о биаллельных нокаутных мутантах в генном редактировании насекомых; обычно получаются мозаичные мутанты, и для получения гомозиготных нокаутных мутантов необходимо проводить селекцию в нескольких поколениях, особенно в случае социальных насекомых с удлиненными яйцами.

Мы предположили, что ранее редактирование генов у большинства насекомых не было направлено непосредственно на зиготы, как у млекопитающих, а было направлено на эмбриональные примордиальные зародышевые клетки. Мы полагали, что эффективность редактирования будет значительно повышена, если зиготы насекомых будут точно нацелены на них, а редактирование генов будет осуществляться в нужное время. Поэтому то, как определить точную область формирования зиготы и подходящее время инъекции, является ключом к достижению высокой эффективности редактирования генов у насекомых.

Со второй половины XIX века проводятся исследования морфологии эмбрионов медоносной пчелы (Cridge et al. 2017). Было получено множество морфологических данных эмбрионов медоносной пчелы. Самое главное, были определены десять стандартных стадий развития эмбрионов медоносной пчелы (DuPraw 1967), которые широко используются для сортировки случайных и несвоевременных эмбрионов из любой колонии. Первая стадия (около 4,5 часов) была определена как период, начинающийся с яйцекладки и заканчивающийся, когда ядра расщепления начинают свою миграцию к заднему полюсу. В начале первой стадии только что отложенное яйцо пчелы находилось в процессе первого мейотического деления (Nachtsheim 1913; DuPraw 1967), и центр деления клеток располагался около цефалического полюса по направлению к вентральной стороне яйца. Примерно через 2 часа яйцеклетка завершает свое созревание и оплодотворяется сперматозоидом, образуя зиготу. Этот физиологический процесс обеспечивает возможность редактирования генов в процессе формирования зиготы с помощью эмбрионов медоносной пчелы.

До сих пор для членистоногих организмов были разработаны и использовались три доставки Cas9 — плазмида, мРНК и белок (Sun et al. 2017). Инъекция комплекса sgRNA и белка Cas9 в область формирования зиготы позволяет нуклеазе Cas9 редактировать гены сразу после инъекции. Как плазмида Cas9, так и мРНК не могут функционировать сразу (Kouranova et al. 2016); им требуется определенное время, чтобы испытать процесс синтеза белка в эмбрионе (Kouranova et al. 2016), и они могут пропустить наиболее подходящее время редактирования. В настоящем исследовании мы ввели sgRNA + белковый комплекс Cas9 в центр расщепления эмбрионов медоносной пчелы во время раннего формирования зиготы, в итоге мы получили одномоментные биаллельные нокаутные эмбрионы медоносной пчелы. Эта улучшенная система редактирования CRISPR/Cas9 эффективна в редактировании генов медоносных пчел и может обеспечить прочную основу для функциональных исследований генов у медоносных пчел.

Материалы и методы

Сбор образцов и изготовление срезов эмбрионов

Образцы эмбрионов Apis mellifera были получены из колоний медоносных пчел, содержащихся на пасеке Научно-исследовательского института медоносных пчел Сельскохозяйственного университета Цзянси, Китай (28,46° с.ш., 115,49° в.д.). Для сбора контролируемых по возрасту эмбрионов спаренную яйцекладущую матку сначала держали в клетках для маток размером 5 см × 3 см × 1,5 см в течение 2-3 ч, а затем помещали в свободные от яиц и расплода зоны подвижного отстроенного гребня; перед помещением матки отстроенный гребень на ночь очищали рабочие пчелы. Во время овуляции королева была ограничена свободным пространством половины гребня (содержащего в общей сложности 1024 ячейки) деревянной или бамбуковой загородкой, которая позволяла рабочим пчелам только входить и выходить, но не позволяла выходить королеве. В процессе ограничения королевы работа с ней и колонией была максимально щадящей, чтобы не напугать королеву и рабочих пчел. Весь процесс проходил в спокойных условиях. Через два часа матка была освобождена.

Мы собрали все свежие эмбрионы Apis mellifera (обычно 30-40 эмбрионов) в течение 2 часов после яйцекладки королевы и использовали десять эмбрионов для изготовления срезов. Десять оставшихся эмбрионов каждый раз отбирали и инкубировали в инкубаторе при 35° и 85% влажности в течение 4 и 6 ч соответственно, и использовали для изготовления срезов. Все собранные 10 яиц фиксировали в 4% параформальдегиде в течение 24 ч, а затем переносили в 20% раствор сахарозы для 48-часового обезвоживания при 4°. Обезвоженные эмбрионы были помещены в смесь с оптимальной температурой резки (OCT), затем разрезаны на 7-мкм секции и помещены на стеклянные предметные стекла. Каждый срез эмбриона окрашивали пропидий йодидом (PI) с концентрацией 50 мкг/мл и сразу же наблюдали с помощью флуоресцентного микроскопа (Leica, Германия), как описано в нашем предыдущем сообщении (Hu et al. 2018).

Подготовка однонаправленной РНК и белка Cas9

В этом исследовании гены Mrjp1 и Pax6 были выбраны в качестве генов-мишеней для редактирования генов. Последовательность целевого сайта sgRNA гена Mrjp1 была 5′-TTGTTTATGCTGGTATGCCTTGG-3′ (подчеркнута последовательность PAM), которая была разработана в соответствии с предыдущим отчетом и расположена на экзоне 2 гена Mrjp1 (Kohno et al. 2016). Для гена Pax6 мы определили целевой сайт сгРНК (5′-GACCATTACCAGACTCTACAAGG-3′; форма от +1106 до +1128 на референсной последовательности XM_006565377.2) в экзоне 2 Pax6 с помощью онлайн-инструмента CCTop (Stemmer et al. 2015; Stemmer et al. 2017). Для получения sgRNAs Mrjp1 и Pax6 был использован подход на основе ПЦР. В качестве прямых праймеров были разработаны специфические олигонуклеотиды, кодирующие сайт связывания полимеразы T7 и целевые последовательности сгРНК Mrjp1 или Pax6 (F-sgRNAMrjp1: 5′-TAATACGACTCACTATAGTTTTTATGCTGGTATGCCTgttttagagctagaaatagc-3′ для Mrjp1; F-sgRNAPax6: 5′-TAATACGACTCACTATAGACCATTACCAGACTCTACAgttttagagctagaaatagc-3′ для Pax6), а в качестве обратного праймера был разработан общий олигонуклеотид, кодирующий остальные последовательности сгРНК (R-Common: 5′-AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCAC-3′). Две пары праймеров для Mrjp1 и Pax6 были отожжены методом ПЦР для синтеза шаблонной ДНК. Реакционная смесь для ПЦР (40 мкл) содержала 20 мкл 2 × Pfu Mastermix (Transgene), 14 мкл H2O, 2 мкл 5 мкМ прямого и обратного праймеров (F-sgRNAMrjp1 или F-sgRNAPax6 и R-Common) и 2 мкл 20 нг/мкл плазмиды pYSY-sgRNA (YaoShunYu, Китай). ПЦР проводили при 95° 3 мин, 30 циклах (95° 30 с, 56° 30 с, 72° 30 с), 72° 10 мин и 12° ∞. Продукты ПЦР очищали с помощью набора для очистки ПЦР (Axygen). Транскрипцию in vitro проводили с помощью набора для транскрипции РНК in vitro HighMAXIscript SP6/T7 (Ambion, США) в соответствии с инструкцией производителя.

Белок Cas9 (TrueCut Cas9 Protein v2) был приобретен у Thermo Fisher Scientific (Шанхай, Китай).

Микроинъекция и выращивание

Королеву медоносной пчелы помещали в тихий, чистый и свободный от яиц гребень и позволяли ей откладывать яйца. Через два часа матка была освобождена. Пластиковые пробки вместе с отложенными яйцами снимали с отстроенного гребня, и прикрепленные яйца были готовы к инъекции.

Мы использовали устройство для микроинъекций (Eppendorf FemtoJet) и микроманипулятор Oxford (Eppendorf TransferMan NK2) для инъекции эмбрионов под инвертированным микроскопом. Одна порция 200 нг/мкл сгРНК Mrjp1 и 200 нг/мкл белка Cas9 была введена эмбрионам медоносной пчелы из партий m1 (n = 24) и m2 (n = 26) в места вентральной стороны вблизи цефалического полюса эмбриона (область формирования зиготы) и дорсальной задней стороны эмбрионов, соответственно. Другая порция 200 нг/мкл Pax6 sgRNA и 200 нг/мкл белка Cas9 была введена эмбрионам медоносной пчелы из партии p3 (n = 22) в места вентральной стороны рядом с цефалическим полюсом эмбриона. Перед инъекцией раствор sgRNA и белка Cas9 хорошо перемешивали и затем помещали на лед на полчаса. Кончики инъекционных игл были жесткими, а внутренний диаметр кончика стеклянной иглы составлял 4 мкм. Когда мы проводили операцию инъекции, угол между иглой и боковой поверхностью яйца был отрегулирован на менее чем 30 градусов, и игла вводилась по направлению от передней стороны к задней. Как только кончик иглы входил в яйцо, производилась инъекция, избегая глубокого введения. Время инъекции составляло 0,1 с, давление инъекции — 600 гПа, а давление равновесия — 50 гПа. Параметры инъекции были аналогичны предыдущему описанию (Schulte et al. 2014). После инъекции необходимо убедиться в целостности яйца. Яйца с переполненной протоплазмой удаляли, так как они погибали из-за повреждений. В месте инъекции яйца обнаруживали прозрачное пятно, которое затем медленно исчезало.

Эмбрионы инкубировали в пластиковых боксах при температуре 35° (относительная влажность 85%) с небольшим количеством 16% (об/об) серной кислоты для предотвращения образования плесени (Schulte et al. 2014).

Процесс предварительного секвенирования мутантов

После микроинъекции яйца инкубировали в течение 48-60 часов. Затем морфологию эмбрионов наблюдали под микроскопом. В это время нормально развитое яйцо находится на девятой стадии эмбрионального развития, и в переднем полюсе имеется очень очевидная заполненная жидкостью щель и выступ на головке амниона-серозы (Рисунок S1), которые могут быть использованы в качестве критерия для отбора. Эмбрионы с нормальным морфогенезом развития были использованы в качестве материала для ПЦР-анализа нокаутных целевых генов. ПЦР для целевых генов проводили в соответствии с инструкциями набора TransDirect Animal Tissue PCR Kit, приобретенного у Transgen Biotech (Пекин, Китай).

Фрагмент (403 п.н.), фланкирующий целевой сайт редактирования в Mrjp1, амплифицировали с помощью пары специфических праймеров (прямой: 5′-ATATTCCATTTGCTTCGTTTACTCG-3′, обратный: 5′-TGGATATATGAAGAATTTTGGACAAG-3′). Фрагмент (446 п.н.), фланкирующий целевой сайт редактирования в Pax6, был амплифицирован с помощью другой пары специфических праймеров (прямой: 5′-GCCGGTGTGTGTTTATTCAA-3′, обратный: 5′- TGCAAAAGTGACATCCTTTGC T-3′). Реакционная смесь для ПЦР (20 мкл) содержала 10 мкл 2 × TransDirect PCR supermix (+ краситель), 0,4 мкл прямых праймеров, 0,4 мкл обратных праймеров, 5,2 мкл ddH2O, 4 мкл жидкости для лизиса эмбрионов. ПЦР проводили при 94° 10 мин, 35 циклов (94° 30 с, 52° 30 с, 72° 1 мин), 72° 10 мин и 12° до отбора продуктов ПЦР. Продукты ПЦР были готовы для секвенирования по Сэнгеру или вставлены в TA векторы для секвенирования по Сэнгеру.

ПЦР отрицательных контролей

Медоносные пчелы, использованные в этом эксперименте, были получены из обычной колонии Apis mellifera без специального разведения. Чтобы лучше определить тип нокаутных мутантов, мы исследовали фланкирующие последовательности вокруг PAM-сайтов генов Mrjp1 и Pax6 в нередактированных эмбрионах, отложенных экспериментальными матками. Для каждого гена было собрано десять нередактированных эмбрионов и проведена ПЦР-амплификация, как и для соответствующих генов-кандидатов. Продукты ПЦР использовались в качестве отрицательных контролей для секвенирования Сэнгера или клонирования TA.

Секвенирование продуктов ПЦР и клонов TA

Секвенирование по методу Сэнгера проводилось с использованием праймеров Mrjp1 или Pax6 в качестве праймера для секвенирования. Различные одиночные пики секвенирования от образцов дикого типа и двойные пики секвенирования, присутствующие в виде кластера оснований, указывали на событие мутации. Все продукты ПЦР, за исключением образцов с очевидными чистыми одиночными пиками, были клонированы в TA, и 20 колоний были отобраны для секвенирования по методу Сэнгера в компании Tsingke Biological Technology (Чанша, Китай) для определения точных типов инделов.

Доступность данных и реагентов

Авторы заявляют, что все данные, необходимые для подтверждения выводов, представленных в статье, полностью представлены на рисунках и в таблицах. Все штаммы медоносных пчел и реактивы доступны по запросу.
Дополнительные материалы доступны здесь

Результаты

Морфологический анализ срезов ранних эмбрионов медоносной пчелы

Чтобы определить разумное место и время инъекции для редактирования генов, мы сначала проанализировали морфологические срезы ранних эмбрионов медоносной пчелы в возрасте примерно 0-2, 4-6 и 6-8 часов (ч). На срезе эмбриона медоносной пчелы в возрасте 0-2 часа (Рисунок 1А) мы увидели, что однородная протоплазма занимала весь эмбрион и имела относительно небольшую структуру. При более глубоком окрашивании мы не смогли обнаружить явных ядер расщепления. Согласно описанию DuPraw (1967), яйцо этого периода еще находится в процессе формирования зиготы, которая находится около цефалического полюса в направлении вентральной стороны яйца, поэтому на срезе нельзя было наблюдать эмергид с глубоким окрашиванием. Как показано на срезе 4-6-часового эмбриона медоносной пчелы (рис. 1В), несколько энергид, образованных ядрами, набирающими свои собственные островки плазмы, были обнаружены вместе с более глубоким окрашиванием вблизи переднего полюса эмбриона. Это была типичная структура эмбриона поздней стадии 1 или ранней стадии 2, что соответствовало морфологии, описанной DuPraw (1967): «В начале 2-й стадии скопление из восьми энергидов находится около 10% уровня (измеренного от переднего полюса), примерно на равном расстоянии от дорсальной, вентральной и латернальной поверхностей». 6-8-часовые эмбрионы медоносной пчелы (рис. 1С) находились на средней или поздней второй стадии эмбрионального развития. В центре расщепления было обнаружено много энегид, но они не были сгруппированы вместе. Все энергиды рассеянно мигрировали к поверхности эмбриона, а некоторые достигли поверхности переднего полюса.

Эти эмбриональные срезы убедили нас в том, что формирование зиготы происходит в области около цефалического полюса на вентральной стороне яйца примерно через 2 часа после яйцекладки королевы.

Мутагенез гена Mrjp1 с помощью CRISPR/Cas9

В партиях m1 и m2 было получено 17 и 15 нормальных эмбрионов; нормальный уровень эмбрионального развития составил 65,4% и 62,5%, соответственно (Таблица 1). Были получены продукты ПЦР всех этих эмбрионов. Типы редактирования этих двух партий целевых генов показаны на рисунках S2 и S3. Мы секвенировали фланкирующий регион вокруг сайта PAM гена Mrjp1 в 10 пустых образцах и обнаружили мутацию T/C в сайте сгРНК гена Mrjp1 (5′-TTGTTTATGCTGTA(T/C)GCCTTGG-3′, рис. 2A), которая не находилась в области распознавания ядра сгРНК Mrjp1.

Различия в эффективности редактирования генов Mrjp1 или Pax6 в разных местах инъекции

В партии m1 среди 17 инъецированных образцов были обнаружены только два химерных эмбриона, 8C и 6C (Рисунок S2). Результаты в партии m2 показали, что в образцах в месте инъекции на вентральной стороне рядом с цефалическим полюсом эмбриона было три типа результатов: (1) первый тип — химера с явными двойными пиками, показанный как образец 1A на рисунке S3, который включал 8 других образцов 2A, 3A, 6A, 9A, 10A, 12A, 14A и 15A; (2) второй тип — полный нокаут-мутант с чистыми одиночными пиками, отличающимися от дикого типа, показанный как образец 11A на рисунке S3. Четыре других образца 4A, 5A, 8A и 13A были включены; и (3) третий тип — полностью неотредактированный образец, как 7A, только один образец принадлежит к этому типу (Рисунок S3).

Продукты ПЦР 11 образцов химер (9 образцов, введенных с вентрально-цефалической стороны, и 2 образца, введенных с дорсально-задней стороны) из партий m1 и m2 были вставлены в TA-клоны, и 20 клонов были случайным образом отобраны и секвенированы. Результаты секвенирования для различных типов редактирования генов показаны на рисунке 2. Мы обнаружили, что эффективность редактирования образцов, введенных с вентральной стороны вблизи цефалического полюса (93,3%), была значительно выше, чем у образцов, введенных с дорсальной задней стороны (11,8%). В целом, 73,3% особей, инъецированных вблизи вентральной стороны цефалического полюса, были биаллельными нокаут-мутантами (5 биаллельных гомозиготных мутантов и 6 биаллельных гетерозиготных мутантов), в то время как при инъекции в дорсальную заднюю сторону эмбрионов было получено только две химеры с низким коэффициентом редактирования (табл. 2). Результаты показали, что эффективность редактирования в месте инъекции вблизи вентральной стороны цефалического полюса была значительно выше, чем в месте инъекции на дорсальной задней стороне.

Типы редактирования всех отредактированных особей в трех партиях экспериментов

Мутагенез гена Pax6 с помощью CRISPR/Cas9

В партии p3 было получено 13 нормальных эмбрионов; процент нормального эмбрионального развития составил 59,1% (Таблица 1). Были получены продукты ПЦР всех этих эмбрионов. Типы редактирования гена Pax6 показаны на рисунке S4. Для гена Pax6 мы также секвенировали последовательности целевого гена 10 образцов дикого типа и обнаружили вариант G/A 5′-GACCATTACCAGACTACAAG(G/A)-3′ на сайте сгРНК, который оказался в сайте PAM (см. последовательности WT-P1 и WT-P2 на рисунке 3), но AGA также является неканоническим сайтом PAM. Сообщалось, что эффективность разрезания ниже, чем у AGG (Kleinstiver et al. 2015; Zhang et al. 2014), что может повлиять на эффективность редактирования.

Для образцов p3, введенных в вентральный участок около цефалического полюса, было получено три результата редактирования: (1) первый тип — химеры с очевидными двойными пиками, включая восемь образцов 1D, 3D, 4D, 5D, 6D, 7D, 8D и 11D; (2) второй тип — полный нокаут с небольшими слабыми пиками, включая три образца 10D, 12D и 13D; и (3) третий тип — полный нокаут с чистыми одиночными пиками, показанными на рисунке S4, включая два образца 2D и 9D. Продукты ПЦР 11 образцов первого и второго типов были вставлены в TA-клоны, а затем 20 клонов для каждого продукта ПЦР были отобраны для секвенирования. Результаты секвенирования для различных типов редактирования генов показаны на рисунке 3. Результаты показали, что эффективность редактирования целевого гена Pax6 была очень высокой и достигала 100% (табл. 2). 76,9% особей, инъецированных в районе вентральной стороны цефалического полюса, были биаллельными нокаут-мутантами (3 биаллельных гомозиготных мутанта и 7 биаллельных гетерозиготных мутантов).

Обсуждение

CRISPR/Cas9-опосредованное редактирование генов достигло огромного успеха и воздействия на многие виды. Однако эффективность редактирования у насекомых была не такой высокой, как у млекопитающих, особенно у тех, у кого яйца вытянутой формы, таких как медоносная пчела (Kohno et al. 2016; Kohno and Kubo 2018; процент отредактированного потомства был ниже 12,5%) и комар (Dong et al. 2015; эффективность нокаута составила 5,5%). Это привело к тому, что технология CRISPR/Cas9 не нашла широкого применения у медоносных пчел. В данном исследовании мы представили усовершенствованный метод редактирования генов CRISPR/Cas9 путем микроинъекции sgRNA и белка Cas9 в область образования зиготы в течение 2 часов после яйцекладки матки, что позволяет одномоментно получать биаллельные нокаутные мутанты у медоносной пчелы с высокой эффективностью.

Сначала мы нацелились на ген Mrjp1. Дизайн сгРНК Mrjp1 был таким же, как и в предыдущем отчете Kohno et al. (2016). Основными целями редактирования гена Mrjp1 медоносной пчелы были: (1) определение времени инъекции, (2) определение места инъекции и (3) определение возможности доставки sgRNA и белка Cas9. Мы хотели узнать, является ли вентральная цефалическая сторона (вблизи места формирования зиготы) более подходящей для места инъекции, чем спинная задняя часть, как было описано ранее (Kohno et al. 2016), и подходят ли яйца на стадии развития формирования зиготы, собранные нашим методом, для редактирования генов. Результаты наших исследований показали, что улучшение вышеуказанных трех аспектов может помочь нам получить высокую скорость редактирования генов у медоносных пчел. Для дальнейшей демонстрации эффективности улучшенной системы редактирования Crispr/Cas9 мы разработали sgRNA для другого целевого гена Pax6. Результаты показали, что эффективность редактирования гена Pax6 также была высокой.

Влияние мутации в sgRNA целевых генов

Мы исследовали химеры (1A, 2A, 6A, 1D, 3D и 10D) в двух партиях редактирования генов Mrjp1 и Pax6. Мы обнаружили, что клоны TA, полученные из химерных эмбрионов Mrjp1, имеют общую особенность: пятнадцатое основание на левом фланге к сайту PAM является последовательностью C (рис. 2). СгРНК Mrjp1, как и в предыдущем отчете, была изначально разработана на основе референсной последовательности гена Mrjp1. Однако результат секвенирования эмбрионов дикого типа показал наличие мутации T > C в пятнадцатом основании на левом фланге сайта PAM. Хотя эта мутация не находится в основной последовательности 6-12 оснований рядом с PAM (Jiang et al. 2013), результаты показывают, что гетерозиготность этого сайта негативно влияет на эффективность редактирования.

Мы сконструировали сгРНК Pax6 в соответствии с референсной последовательностью NCBI гена Pax6. Однако, основываясь на результатах секвенирования эмбрионов дикого типа, мы обнаружили мутацию G > A в сайте PAM (рис. S3) на последовательности распознавания направляющей РНК. Предыдущее исследование показало, что и AGG, и AGA являются узнаваемыми PAM-сайтами, но эффективность редактирования AGG выше, чем AGA (Kleinstiver et al. 2015; Zhang et al. 2014). В нашем случае, судя по результатам секвенирования клонов TA, все неотредактированные последовательности (n = 3) содержали AGA PAM, который был обнаружен лишь в небольшой доле всех протестированных эмбрионов; большинство последовательностей (n = 40), содержащих AGA, были отредактированы при мутагенезе Pax6. Самая низкая степень редактирования целевого гена Pax6 составила 95%. Это позволило предположить, что сгРНК Pax6, использованная в нашем исследовании, была относительно специфичной.

Усовершенствования в нашей системе редактирования генов медоносной пчелы

В этом исследовании мы скорректировали время инъекции, место инъекции и доставку инъекции к эмбрионам медоносной пчелы с целью прямого попадания в зиготу медоносной пчелы и определения оптимального момента времени для редактирования генов. Мы значительно улучшили методологию редактирования генов у медоносных пчел с технической точки зрения. К счастью, мы наконец-то достигли высокой эффективности редактирования генов у медоносной пчелы и одномоментного получения биаллельных мутантов медоносной пчелы. Таким образом, мы разработали метод эффективного редактирования генов у медоносной пчелы, что стало очевидным технологическим усовершенствованием по сравнению с ранее созданной методикой (Kohno et al. 2016).

Здесь мы кратко описали три основных усовершенствования нашей системы редактирования генов медоносной пчелы:

Во-первых, для медоносной пчелы, насекомого с удлиненным эмбрионом, редактирование генов в правильном эмбриональном положении и в точное время эмбрионального развития является важным технологическим усовершенствованием и ключом к получению высокоэффективных результатов редактирования генов. В предыдущих исследованиях генетических манипуляций у медоносной пчелы (Schulte et al. 2014; Kohno et al. 2016; Kohno and Kubo 2018) для инъекции выбиралось положение примитивных гонадных клеток (дорсальная задняя область эмбрионов), что приводило к получению мозаичных маток или низкой эффективности трансгенеза (27% и 20%) или редактирования генов (< 12,5%). И требовался сложный процесс селекции для получения потомства мутантов. Однако у млекопитающих, таких как мыши (Wang et al. 2013), крысы (Li et al. 2013) и свиньи (Hai et al. 2014), зигота была непосредственно нацелена как объект инъекции для редактирования генов, и биаллельные нокдаун-мутанты могли быть получены в текущем поколении (поколение G0) путем одномоментной инъекции. Поэтому мы посчитали, что нацеливание на зиготу медоносной пчелы вместо примитивных клеток гонад должно стать ключом к достижению высокоэффективных результатов редактирования генов у медоносной пчелы. Перед инъекцией эмбрионов мы уделили больше внимания развитию эмбрионов медоносной пчелы. Удлиненное яйцо медоносной пчелы значительно отличается от круглого или почти круглого яйца плодовой мухи, шелкопряда или других насекомых по морфологической и анатомической структуре. Мы внимательно прочитали и поняли предыдущую литературу о развитии эмбриона медоносной пчелы и наблюдали гистологическое строение ранних эмбрионов медоносной пчелы. Мы убедились, что формирование зиготы в эмбрионах медоносной пчелы происходит примерно через два часа после овуляции матки, а местом формирования зиготы медоносной пчелы является участок вентральной стороны рядом с цефалическим полюсом эмбриона. Кроме того, чтобы нуклеаза Cas9 могла редактировать гены сразу после инъекции, мы выбрали комплекс sgRNA и белка Cas9 в качестве доставки инъекции и ввели комплекс в область формирования зиготы медоносной пчелы. Хотя и плазмиде Cas9, и мРНК требуется определенное время для процесса синтеза белка в эмбрионе (Kouranova et al. 2016), мы можем пропустить подходящее время для редактирования на стадии 1-2 клеток зиготы пчелы. Наконец, мы успешно осуществили высокоэффективное редактирование генов в эмбрионах медоносной пчелы. Мы можем сделать вывод, что улучшение места инъекции, времени и доставки привело к высокой эффективности редактирования генов медоносной пчелы. Этот метод, который мы создали, также послужил основой для редактирования генов у других насекомых с удлиненными эмбрионами.

Во-вторых, по сравнению с предыдущей методикой редактирования генов медоносных пчел, эффективность генерации мутантов значительно повысилась. Насколько нам известно, в двух работах группы Кубо (Kohno et al. 2016; Kohno and Kubo 2018) сообщалось о редактировании генов CRISPR/Cas9 у медоносных пчел. В них эффективность генерации мутантов медоносной пчелы составила 12,4%, 5,1% и 10%, соответственно. В то время как в нашем исследовании эффективность биаллельных мутантов для двух генов-кандидатов составила 73,3% и 76,9% соответственно, что значительно выше, чем в исследованиях группы Кубо.

В-третьих, одноэтапный высокоэффективный метод редактирования генов, созданный в нашем настоящем исследовании, может значительно ускорить получение биаллельных нокаутных мутантов медоносной пчелы. При предыдущем применении CRISPR/Cas9 у медоносных пчел, биаллельные нокаутные мутанты медоносной пчелы могли быть получены только путем сложных процедур селекции в течение нескольких поколений. Обычно требовалось вырастить три поколения маток с мутировавшим геном (Kohno et al. 2016; Kohno and Kubo 2018). Медоносная пчела — типичное социальное насекомое. У медоносных пчел есть три касты: трутни, рабочие и королевы. Дроны — самцы, а рабочие и королевы — самки. Гаплоидные эмбрионы развиваются в трутней; диплоидные эмбрионы развиваются в рабочих пчел или королев. Развитие медоносной пчелы состоит из четырех стадий: эмбрион, личинка, куколка и взрослая особь. На стадии личинки существует большая разница в питании пчел между личинками, развивающимися в маток, и личинками, развивающимися в рабочих пчел, что контролируется рабочими пчелами, на которых лежит обязанность кормить расплод. Другими словами, производство маток требует кормления пчел-кормилиц. Насколько нам известно, не было сообщений о том, что маток можно искусственно разводить без кормления пчелами-кормилицами. Было трудно добиться искусственного разведения маток с репродуктивной способностью. Личинки, готовые к развитию в маток, должны были быть перенесены в естественную колонию и выкормлены пчелами-кормилицами. Кроме того, пчелы-кормилицы должны были строго следить за вылупляющимися яйцами и личинками в естественной колонии. Если обнаруживались слабые или поврежденные эмбрионы, их удаляли. Инъецированные эмбрионы были неизбежно повреждены в определенной степени по сравнению с нормальными эмбрионами. Поэтому существовала большая вероятность того, что инъецированные эмбрионы будут вычищены пчелами-кормилицами. По этим причинам в процессе получения мутантных рабочих пчел методом микроинъекционного редактирования генов CRISPR/Cas9 процесс развития от инъецированных эмбрионов до маток становился узким местом, что легко приводило к неудаче всего эксперимента или значительному снижению эффективности эксперимента.

В нашем настоящем исследовании мы разработали одноэтапный высокоэффективный метод редактирования генов. Мы смогли получить биаллельные мутанты путем выращивания одного поколения рабочих пчел. Наш метод позволяет избежать сложного процесса разведения маток и значительно снижает сложность всего эксперимента по редактированию генов медоносной пчелы. Его применение у медоносных пчел также позволяет быстро выявить фенотипы мутантов с нокаутом генов. Кроме того, этот эффективный подход к редактированию генов дает возможность проводить функциональные исследования генов, критически важных для развития от эмбриона до взрослой особи. В целом, мы считаем, что усовершенствование метода редактирования генов медоносной пчелы было очевидным с технологической точки зрения, а его эффект и значение были значительными.

Наконец, следует отметить, что мы не выращивали отредактированные эмбрионы в личинок или взрослых особей. Эффективность нашего метода ожидает тестирования в системе от яйца до взрослой особи, чтобы убедиться в отсутствии неожиданных проблем, связанных с инъекционными инновациями в процессе выращивания.

Выводы

В настоящем исследовании мы нацелились на область формирования зиготы на стадии 1-2 клеток, ввели комплекс, образованный sgRNA и белком Cas9 в качестве доставки, в эмбрионы медоносных пчел и провели эксперименты по редактированию генов Mrjp1 и Pax6. Результаты показали, что созданная нами система редактирования CRISPR/Cas9 способна с высокой эффективностью создавать у медоносных пчел нокаутные мутантные эмбрионы G0. Эта эффективная система редактирования CRISPR/Cas9 прокладывает дорогу для функциональных исследований генов у медоносных пчел и служит полезной ссылкой для редактирования генов у других насекомых.

Сноски

Дополнительные материалы доступны на сайте Figshare:

Рисунок S1: скачать здесь

Рисунок S2: скачать здесь

Рисунок S3: скачать здесь

Рисунок S4: скачать здесь

Цитируемая литература

1.Aizen M A, Harder L D, 2009 The global stock of domesticated honey bees is growing slower than agricultural demand for pollination. Curr. Biol.19: 915–918. 10.1016/j.cub.2009.03.071
Google Scholar Crossref PubMed WorldCat

2.Belhaj K, Chaparro-Garcia A, Kamoun S, Nekrasov V, 2013 Plant genome editing made easy: targeted mutagenesis in model and crop plants using the CRISPR/Cas system.Plant Methods 9: 39.10.1186/1746-4811-9-39
Google Scholar Crossref PubMed WorldCat

3.Beye M, Hartel S, Hagen A, Hasselmann M, Omholt S W, 2002 Specific developmental gene silencing in the honey bee using a homeobox motif. Insect Mol. Biol.11: 527–532. 10.1046/j.1365-2583.2002.00361.x
Google Scholar Crossref PubMed WorldCat

4.Bonabeau E, Theraulaz G, Deneubourg J L, AronS, Camazine S, 1997 Self-organization in social insects.Trends Ecol. Evol.12: 188–193. 10.1016/S0169-5347(97)01048-3
Google Scholar Crossref PubMed WorldCat

5.Caron D M, Connor L J, 2013 Honey bee biology and beekeeping, Wicwas Press, Kalamazoo, Michigan.
Google Scholar Google Preview WorldCat COPAC

6.Cridge A G, Lovegrove M R, SkellyJ G, Taylor S E, Petersen G E L et al. , 2017 The honeybee as a model insect for developmental genetics.Genesis55: e23019. 10.1002/dvg.23019
Google Scholar Crossref WorldCat

7.Dearden, P. K., E. J. Duncan, and M. J. Wilson, 2009 RNA interference (RNAi) in honeybee (Apis mellifera) embryos. Cold Spring Harb Protoc 2009 (6):pdb prot5228.

8.Dong S, Lin J, Held N L, Clem R J, Passarelli A L et al. , 2015 Heritable CRISPR/Cas9-mediated genome editing in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. PLoS One10: e0122353. 10.1371/journal.pone.0122353
Google Scholar Crossref PubMed WorldCat

9.DuPraw, E. J., 1967 The honeybee embryo. Methods in developmental biology:183–217.

10.Fleig R, 1990 Engrailed expression and body segmentation in the honeybee Apis mellifera. Rouxs Arch. Dev. Biol.198: 467–473. 10.1007/BF00399057
Google Scholar Crossref PubMed WorldCat

11.Fleig R, Walldorf U, Gehring W J, Sander K, 1988 In situ localization of the transcripts of a homeobox gene in the honeybee Apis mellifera L. (Hymenoptera). Rouxs Arch. Dev. Biol.197: 269–274. 10.1007/BF00380020
Google Scholar Crossref PubMed WorldCat

12.Franks N R, Pratt S C, Mallon E B, Britton N F, Sumpter D J, 2002 Information flow, opinion polling and collective intelligence in house-hunting social insects.Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci.357: 1567–1583. 10.1098/rstb.2002.1066
Google Scholar Crossref PubMed WorldCat

13.Gratz S J, Cummings A M, Nguyen J N, Hamm D C, Donohue L K et al. , 2013 Genome engineering of Drosophila with the CRISPR RNA-guided Cas9 nuclease. Genetics194: 1029–1035. 10.1534/genetics.113.152710
Google Scholar Crossref PubMed WorldCat

14.Hai T, Teng F, Guo R, Li W, Zhou Q, 2014 One-step generation of knockout pigs by zygote injection of CRISPR/Cas system. Cell Res.24: 372–375. 10.1038/cr.2014.11
Google Scholar Crossref PubMed WorldCat

15.Hu X, Ke L, Wang Z, Zeng Z, 2018 Dynamic transcriptome landscape of Asian domestic honeybee (Apis cerana) embryonic development revealed by high-quality RNA sequencing. BMC Dev. Biol.18: 11. 10.1186/s12861-018-0169-1
Google Scholar Crossref PubMed WorldCat

16.Hwang W Y, Fu Y, Reyon D, Maeder M L, Tsai S Q et al. , 2013 Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat. Biotechnol.31: 227–229. 10.1038/nbt.2501
Google Scholar Crossref PubMed WorldCat

17.Jiang W, Bikard D, Cox D, Zhang F, Marraffini L A, 2013 RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems.Nat. Biotechnol.31: 233–239. 10.1038/nbt.2508
Google Scholar Crossref PubMed WorldCat

18.Klein A M, Vaissiere B E, Cane J H, Steffan-DewenterI, Cunningham S A et al. , 2007 Importance of pollinators in changing landscapes for world crops.Proc. Biol. Sci.274: 303–313. 10.1098/rspb.2006.3721
Google Scholar Crossref PubMed WorldCat

19.Kleinstiver B P, Prew M S, Tsai S Q, Topkar V V, Nguyen N T et al. , 2015 Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities. Nature523: 481–485. 10.1038/nature14592
Google Scholar Crossref PubMed WorldCat

20.Kohno H, Kubo T, 2018 mKast is dispensable for normal development and sexual maturation of the male European honeybee.Sci. Rep.8: 11877. 10.1038/s41598-018-30380-2
Google Scholar Crossref PubMed WorldCat

21.Kohno H, Suenami S, Takeuchi H, Sasaki T, Kubo T, 2016 Production of Knockout Mutants by CRISPR/Cas9 in the European Honeybee, Apis mellifera L.Zool. Sci.33: 505–512. 10.2108/zs160043
Google Scholar Crossref WorldCat

22.Kouranova E, Forbes K, Zhao G, Warren J, Bartels A et al. , 2016 CRISPRs for Optimal Targeting: Delivery of CRISPR Components as DNA, RNA, and Protein into Cultured Cells and Single-CellEmbryos.Hum. Gene Ther.27: 464–475. 10.1089/hum.2016.009
Google Scholar Crossref PubMed WorldCat

23.Li M, Au L Y C, Douglah D, Chong A, White B J et al. , 2017 Generation of heritable germline mutations in the jewel wasp Nasonia vitripennis using CRISPR/Cas9.Sci. Rep.7: 901. 10.1038/s41598-017-00990-3
Google Scholar Crossref PubMed WorldCat

24.Li W, Teng F, Li T, Zhou Q, 2013 Simultaneous generation and germline transmission of multiple gene mutations in rat using CRISPR-Cas systems.Nat. Biotechnol.31: 684–686. 10.1038/nbt.2652
Google Scholar Crossref PubMed WorldCat

25.Menzel R, Muller U, 1996 Learning and memory in honeybees: from behavior to neural substrates.Annu. Rev. Neurosci.19: 379–404. 10.1146/annurev.ne.19.030196.002115
Google Scholar Crossref PubMed WorldCat

26.Nachtsheim H, 1913 Cytologische Studien über die Geschlechtsbestimmung bei der Honigbiene Apis Mellifica L, Wilhelm Engelmann, Leipzig, Berlin.
Google Scholar Google Preview WorldCat COPAC

27.Osborne P, Dearden P K, 2005 Non-radioactive in-situ hybridisation to honeybee embryos and ovaries.Apidologie (Celle)36: 113–118. 10.1051/apido:2004075
Google Scholar Crossref WorldCat

28.Perry M, Kinoshita M, Saldi G, Huo L, Arikawa K et al. , 2016 Molecular logic behind the three-way stochastic choices that expand butterfly colour vision.Nature535: 280–284. 10.1038/nature18616
Google Scholar Crossref PubMed WorldCat

29.Schulte C, Theilenberg E, Muller-Borg M, Gempe T, Beye M, 2014 Highly efficient integration and expression of piggyBac-derived cassettes in the honeybee (Apis mellifera).Proc. Natl. Acad. Sci. USA111: 9003–9008. 10.1073/pnas.1402341111
Google Scholar Crossref WorldCat

30.Stemmer M, Thumberger T, Del Sol Keyer M, Wittbrodt J, Mateo J L, 2015 CCTop: An Intuitive, Flexible and Reliable CRISPR/Cas9 Target Prediction Tool.PLoS One10: e0124633. Erratum: 12: e0176619. 10.1371/journal.pone.0124633
Google Scholar Crossref PubMed WorldCat

31.Sun D, Guo Z, Liu Y, Zhang Y, 2017 Progress and Prospects of CRISPR/Cas Systems in Insects and Other Arthropods.Front. Physiol.8: 608. 10.3389/fphys.2017.00608
Google Scholar Crossref PubMed WorldCat

32.Walldorf U, Fleig R, Gehring W J, 1989 Comparison of homeobox-containing genes of the honeybee and Drosophila.Proc. Natl. Acad. Sci. USA86: 9971–9975. 10.1073/pnas.86.24.9971
Google Scholar Crossref WorldCat

33.Wang Y, Li Z, Xu J, Zeng B, Ling L et al. , 2013 The CRISPR/Cas system mediates efficient genome engineering in Bombyx mori.Cell Res.23: 1414–1416. 10.1038/cr.2013.146
Google Scholar Crossref PubMed WorldCat

34.Williams N M, Crone E E, T’ai H R, Minckley R L, Packer L et al. , 2010 Ecological and life-history traits predict bee species responses to environmental disturbances.Biol. Conserv.143: 2280–2291. 10.1016/j.biocon.2010.03.024
Google Scholar Crossref WorldCat

35.Winston M L, 1991 The biology of the honey bee, Harvard University Press, the United States of America.
Google Scholar Google Preview WorldCat COPAC

36.Zhang Y, Ge X, Yang F, Zhang L, Zheng J et al. , 2014 Comparison of non-canonical PAMs for CRISPR/Cas9-mediated DNA cleavage in human cells.Sci. Rep.4: 5405. 10.1038/srep05405
Google Scholar Crossref PubMed WorldCat